1.本发明涉及地龙蛋白提取技术领域，具体涉及一种液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法。

背景技术：

2.地龙在我国有四千年的入药史。地龙，又称蚯蚓，味咸，性寒，归肝、脾、膀胱经，具有清热平肝，消炎止痛，活血化瘀，以及主治高热狂燥等功效。《黄帝内经》记载地龙“善走窜”；《神农本草经》记载地龙“清热定惊，通经活络，活血化瘀，平喘利尿”；《本草纲目》记载“通经络，活血化瘀，平肝泻火，故对瘀血阻于络脉者多有效”。

3.现代研究证实，地龙具有再生血管、神经、肌肉的超自然能力。地龙中提取的多种活性蛋白，是各种血栓的“克星”，能溶解血栓、治疗心脑血管病，降低血脂，血粘，促进神经修复及再生；有抗癌作用。甚至在中老年哮喘、糖尿病、高血压、男性肾虚、性功能下降等方面也“表现非凡”。

4.现在已经从地龙中提取并分离出多种药理活性成份，包括：蚓激酶、纤溶酶、纤溶酶激活剂、钙调素、钙调素结合蛋白、胆碱酯酶、过氧化氢酶，抗微生物蛋白，收缩血管蛋白，溶血蛋白，免疫球蛋白样粘连物以及抗肿瘤等成份。

5.但传统地龙的加工工艺多采用晒干、蒸、煮，并使用粉碎机粉碎。传统工艺炮制条件下，新鲜地龙的自然晒干成为干燥品，要经历较长的时间，在这期间，地龙的组织及细胞会逐渐被破坏，导致蛋白类活性成份的降解；另外，地龙蛋白在外界不良的理化环境下，容易变性，导致生物活性丧失。

6.在粉碎过程中高速旋转的粉碎机也会产生高温，高温同样会导致蛋白质变性，失去生物活性。经研究证实，采用晒干工艺制备的地龙干燥体中，几乎不含蚓激酶，纤溶活性几乎被完全破坏。

技术实现要素：

7.本发明的目的是提供液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法。

8.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

9.本发明提供液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤:

10.步骤1：将地龙洗净，辐照30分钟灭菌，移入研钵，加入5-10ml/g液氮，将地龙活体迅速冷冻至-196℃；将冻块用压力粉碎，将粉末移至研钵研磨；

11.步骤2：在研磨过程中，边研磨边加液氮，每次加液氮1-2ml/g，直至研成细末，细末粒度要小于70目，再移至冻干瓶中，冷冻干燥，制成地龙冻干粉，放入冰箱保存；

12.步骤3：将地龙冻干粉在3～5℃制成溶液，将浆料离心取上清液，加入胰酶，进行膜过柱操作，采用截留一万到五万道尔顿的超滤膜进行超滤，得到滤液一号和滤过液一号；将滤液一号进行提纯，再次冷冻干燥，得到地龙蛋白一号，主要成份是蚓激酶和超氧化物歧化酶；

13.步骤4：将滤过液一号再次进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进超滤，得到滤液二号和滤过液二号，将滤液二号提纯，冷冻干燥，得到地龙蛋白二号，主要成分是地龙蛋白；

14.步骤5：将滤过液二号再次进行膜过柱操作，采用截留小于5万道尔顿的超滤膜过滤，得滤液三号，冷冻干燥，得到地龙蛋白三号，主要成分是地龙蛋白多肽；

15.步骤6：将地龙蛋白一号、地龙蛋白二号、地龙蛋白三号，在3～5℃的环境下混合，再喷雾干燥，形成地龙蛋白粉。

16.本发明的有益效果在于：可以在短时间内冻结内部组织细胞的生物活性，进而在低温条件下，研磨成粉末后，用冷冻干燥技术，制成冻干粉，可以有效阻止地龙生物酶的变性，避免蛋白类成份的降解和变性，从而大幅度提高地龙蛋白有效成份含量，从而大幅度提高临床使用效果。

具体实施方式

17.下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

18.原料选择：

19.1、赤子爱胜蚓(大唐六号)

20.地龙有很强的再生能力，因此现代研究认为地龙中有种活性成份，具有溶栓和促进神经再生的能力。但并非所有的地龙都有再生能力，地球上约有2400种地龙，陆正蚓就几乎没有再生能力。

21.中药材中常用的是广地龙，呈紫灰色，身体胖壮，易于养殖，繁殖快，广地龙的纤溶酶有三个纤溶组分，有良好的耙向作用，长于溶解血栓，且不导致出血。

22.现在临床使用最多的是日本的赤子爱胜蚓，它的纤溶酶有五个活性组分。我国引进赤子爱胜蚓后，通过多代杂交，形成的太湖红蚯蚓、川蚓一号、大平一号、大平二号等品种，纤溶酶活性组分在5-7个之间。

23.赤子爱胜蚓(大唐六号)是大唐良行采用日本的赤子爱胜蚓与传统中药广地龙进行多代杂交，融合了广地龙溶栓的耙向作用，和赤子爱胜蚓纤溶组分高的特点，形成杂交优势。赤子爱胜蚓(大唐六号)地龙呈橙红色，身体健壮，体长在200毫米至500毫米，直径在8-15毫升，其纤溶酶的活性组分高达32个。本提取工艺，使用大唐六号地龙。

24.2、原料准备

25.将新鲜赤子爱胜蚓(大唐六号)地龙500克洗净，放入清水中，温度设置在5-20度，静置5小时以上，排出地龙体内的粪便，再次清洗备用。

26.3、设备及试剂

27.美国labconco 77530-01冷冻干燥机，美国bio-rad蛋白质电泳系统，aet-40sm十万分之一电子天平，苏州cj-1f型医用超净台，美国nu-4750型培养箱。胰酶，胎牛血清，甘油，n-亚甲基双丙烯酰胺、dmem培养基。

28.4、液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法

29.将赤子爱胜蚓(大唐六号)洗净，辐照30分钟灭菌，移入研钵，加入适量液氮(5-10ml/g)，将地龙活体迅速冷冻至-196℃。将冻块用压力粉碎，将粉末移至研钵研磨。

30.在研磨过程中，边研磨，边加液氮(每次加液氮1-2ml/g)，直至研成细末(粒度要小于70目)，再移至冻干瓶中，冷冻干燥，制成地龙冻干粉，放入冰箱保存。

31.将地龙冻干粉在4℃左右制成溶液，将浆料离心取上清液，加入胰酶，进行膜过柱操作，采用截留一万到五万道尔顿的超滤膜进行超滤，得到滤液一号和滤过液一号。将滤液一号进行提纯，再次冷冻干燥，得到地龙蛋白一号，主要成份是蚓激酶和超氧化物歧化酶。

32.将滤过液一号，再次进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进超滤，得到滤液二号和滤过液二号，将滤液二号提纯，冷冻干燥，得到地龙蛋白二号，主要成分是地龙蛋白。

33.将滤过液二号再次进行膜过柱操作，采用截留小于5万道尔顿的超滤膜过滤，得滤液三号，冷冻干燥，得到地龙蛋白三号，主要成分是地龙蛋白多肽。

34.将地龙蛋白一号二号三号，在4℃左右的环境下混合，再喷雾干燥，形成地龙蛋白粉。

35.使用本方法可以在短时间内冻结内部组织细胞的生物活性，进而在低温条件下，研磨成粉末后，用冷冻干燥技术，制成冻干粉，可以有效阻止地龙生物酶的变性，避免蛋白类成份的降解和变性，从而大幅度提高地龙蛋白有效成份含量，从而大幅度提高临床使用效果。

36.通过液氮快速冷冻以及快速冷冻干燥技术，提取的活性地龙蛋白，其活性成份大约是传统炮制工艺的五到六倍。其原因，一是赤子爱胜蚓(大唐六号)经过多代杂交驯化，具备了传统中药广地龙耙向作用和日本赤子爱胜蚓纤溶活性成份含量高的特点；二是快速冷冻及快速干燥，在加工过程中不破坏地龙蛋白的活性。利用这方法提取的地龙蛋白，含量高，活性强，效果好。可以用于医药保健领域，有很好的溶栓、降脂、通血管、促进神经再生、抗肿瘤作用。

37.液氮低温冷冻技术以及快速低温干燥技术加工的地龙蛋白，纤溶活性约为480u/ml，而传统炮制工艺为160u/ml；体外溶栓实验也证实，低温炮制的地龙蛋白，体外溶栓指数为70％左右，传统炮制加工的地龙，溶栓指数仅为24％左右，即低温炮制的地龙蛋白其溶栓效果是传统炮制工艺的3倍以上。

38.在水溶性蛋白抗肿瘤实验中，低温炮制的地龙蛋白对肿瘤的抑制率(高达36％)是传统炮制工艺的2倍以上。(2007年7月中草药第七期《液氮快速冷冻对地龙中水溶性蛋白组成和活性的影响》)。

39.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将地龙洗净，辐照30分钟灭菌，移入研钵，加入5-10ml/g液氮，将地龙活体迅速冷冻至-196℃；将冻块用压力粉碎，将粉末移至研钵研磨；步骤2：在研磨过程中，边研磨边加液氮，每次加液氮1-2ml/g，直至研成细末，细末粒度要小于70目，再移至冻干瓶中，冷冻干燥，制成地龙冻干粉，放入冰箱保存；步骤3：将地龙冻干粉在3～5℃制成溶液，将浆料离心取上清液，加入胰酶，进行膜过柱操作，采用截留一万到五万道尔顿的超滤膜进行超滤，得到滤液一号和滤过液一号；将滤液一号进行提纯，再次冷冻干燥，得到地龙蛋白一号，主要成份是蚓激酶和超氧化物歧化酶；步骤4：将滤过液一号再次进行膜过柱操作，采用截留分子量大于5万道尔顿的超滤膜进超滤，得到滤液二号和滤过液二号，将滤液二号提纯，冷冻干燥，得到地龙蛋白二号，主要成分是地龙蛋白；步骤5：将滤过液二号再次进行膜过柱操作，采用截留小于5万道尔顿的超滤膜过滤，得滤液三号，冷冻干燥，得到地龙蛋白三号，主要成分是地龙蛋白多肽；步骤6：将地龙蛋白一号、地龙蛋白二号、地龙蛋白三号，在3～5℃的环境下混合，再喷雾干燥，形成地龙蛋白粉。

技术总结

本发明公开了液氮快速冷冻提取活性地龙蛋白的方法，包括如下步骤：步骤1：将地龙辐照30分钟灭菌，移入研钵，加入5-10ml/g液氮，将地龙活体迅速冷冻至-196℃；将冻块用压力粉碎研磨；步骤2：边研磨边加液氮，每次加液氮1-2ml/g，直至研成细末，细末粒度要小于70目，再冷冻干燥制成地龙冻干粉；步骤3：得到地龙蛋白一号，主要成份蚓激酶和超氧化物歧化酶；步骤4：得到地龙蛋白二号，主要成分地龙蛋白；步骤5：得到地龙蛋白三号，主要成分地龙蛋白多肽；步骤6：将地龙蛋白一号二号三号在3～5℃的环境下混合，再喷雾干燥，形成地龙蛋白粉。本发明方法可以在短时间内冻结内部组织细胞的生物活性，有效阻止地龙生物酶的变性，避免蛋白类成份的降解和变性。份的降解和变性。

技术研发人员：邓红伟

受保护的技术使用者：徐州大唐良行生物科技有限公司

技术研发日：2022.06.01

技术公布日：2022/9/2