41、造成杂交不孕和杂种不育的原因是什么?(第项5分)
答案：
造成杂交不孕和杂种不育的原因是由于物种之间存在的生殖隔离。造成生殖隔离的原因：
1、地理隔离
由于地理因素造成的隔离,如不同的水域之间、不同的河流之间造成群体之间的不可相遇而形成两个群体之间的隔离,长期的隔离阻断了两物种之间的基因流动,进而导致生殖隔离。
2、季节隔离
由于动物繁殖季节不同,即使在同一地区也无法交配,因而造成的隔离。如大麻哈鱼溯河生殖的时期不同导致不同群体间的生殖隔离。
3、生理隔离
动物存在性选择,只选择或接受同种的异性个体交配,而拒绝异种的异性个体。
42、生殖隔离有哪几种?如何克服?(第项5分)
答案：
1、地理隔离
由于地理因素造成的隔离,如不同的水域之间、不同的河流之间造成群体之间的不可相遇而形成两个群体之间的隔离,长期的隔离阻断了两物种之间的基因流动,进而导致生殖隔离。
2、季节隔离
由于动物繁殖季节不同,即使在同一地区也无法交配,因而造成的隔离。如大麻哈鱼溯河生殖的时期不同导致不同群体间的生殖隔离。
3、生理隔离
动物存在性选择,只选择或接受同种的异性个体交配,而拒绝异种的异性个体。
无论是哪一种类型,均可通过人工授精打破生殖隔离。
43、远缘杂交的可育性分为哪几种情况?(第项5分)
答案：
1、种间杂种
同一属内的不同种间杂交,比属间杂交的可育性大,有许多完全可育(全育型)的种类。
2、属间杂种
(1)完全可育:杂种一代不论雌雄均能发育。可全部达到性成熟,其性腺指数、怀卵量、精子数量接近亲本,受精率、孵化率正常,如鳊鲂杂种、鲢鳙杂种。
(2)完全不育:杂种性腺不发育。
(3)单性可育:杂种只有雄性或雌性能发育到性成熟,另一性别则不发育。如鲤鲫杂种(目前发现部分雄性个体是可育的)。
3、亚科间杂种
不同亚科间的远缘杂交,至今未见报道能育的杂种,一般认为是不育的。亚科间杂种的完全不育,可能与杂交不亲和性很难产生二倍体的杂种有关。
44、多倍体是怎样形成的?(第三项6分，其余每项3分)
答案：
1、体细胞染色体加倍
核内有丝分裂是体细胞在正常有丝分裂中,染色体复制一次,但至分裂中期,核膜没有破裂、消失,也无纺锤丝的形成, 因此每对染色体形成4条染色体,称为双倍染色体。这时染色体两两平行排列在一起,结果形成的细胞是四倍体。其后经过正常的细胞分裂,形成两个子细胞均为四倍体。
2、生殖细胞的异常减数分裂
由于某种原因同源染色体或姐妹染色单体在后期没有分开,二组染色体进人到同一配子中,导致配子中染色体数目的加倍形成2n 配子。这样的配子经受精后形成倍性不同于亲代的多倍体,如三倍体、四倍体等,但其子代的可育性很低。
3、双(多)精受精
动物的受精机制保证只有一个精子进人卵子。在一些鱼类中：
精子→雄配子素Ⅱ→溶解卵膜孔的卵膜形成受精孔→卵子的雌配子素I→吸引和加速精子人卵→雌配子素Ⅱ→卵膜孔封闭→破坏孔外精子→单精受精→精卵两核的融合。
当受精孔由于某些生理的或自然的原因不能及时封闭时,则可能有两个或多个精子入卵, 形成三倍体(双精)、四倍体(三精)的合子并发育形成多倍体个体。
4、远缘杂交
不同二倍体物种之间杂交,当血缘关系比较近时形成异源二倍体杂交种;当杂交的两个物种血缘关系较远,会产生杂交种不育现象;如果遗传基础差异较大,杂交很难获得二倍体杂种,但有时远缘杂交可以导致远缘多倍体的形成。
45、多倍体的应用主要体现在哪几方面?(第四项6分，其余每项3分)
答案：
1、染色体计数法(贝类染色体制片法)
用担轮幼虫制备染色体标本(以皱纹盘鲍为例)
受精卵在25℃条件下培养6~8h,取上浮担轮幼虫,用0.01%的秋水仙素(用于制备中期染色体)溶液浸泡处理2~3h;离心5min(1000r/min);用0.075mol/L的KCl预低渗10min,离心5min(1000r/min),再用0.075mol/L KCl低渗30min,离心5min(1000r/min) ;用卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定15min,离心5min(1000r/min);重复固定4次(每次15min) ;置于-18℃冰箱中储存过夜(>12h) ;离心5min(1000r/min);加50%冰醋酸1~2滴解离1~2min;滴片前用固定液(甲醇:冰醋酸=1:1)固定;在50℃ 灯箱上进行热滴片;自然干燥后,用Giemsa染液染色1h;用蒸馏水冲洗后,在空气中干燥;镜检统计染色体数。
2、细胞核体积测量
一般认为,真核细胞的核大小与染色体数目成正比,同时细胞核与细胞质在细胞中总是维持较稳定的核质比。因此,细胞及细胞核体积的大小可用于染色体倍性鉴定。根据细胞核或细胞的体积即可确定其倍性。计算公式：核面积=πab/4;核体积=4/3πab2或=ab2/1.91式中,a为短轴长度,b为长轴长度。
二倍体与三倍体红细胞核体积预期比值为1:1.5,核面积预期比值为1:1.3,二倍体与四倍体红细胞核体积预期比值为1:1.74。
3、极体计数法
因为三倍体的诱导是通过阻止第一极体或第二极体的排出而完成的,所以三倍体合子只有一个而不是两个极体。具体方法是在显微镜下观察卵子的动物极有没有极体释放。该方法在大扇贝和珍珠贝中很有效,但对于早期胚胎极体不易观察的种类则需通过组织学方法观察极体的释放。
4、DNA含量测定方法
(1)流式细胞仪检测
用DNA-RNA特异性荧光染料(如DAPI)对细胞进行染色,在流式细胞仪上用激光或紫外光激发结合在DNA上的荧光染料,检测每个细胞的荧光强度,其强度与DNA含量成正比，与已知的二倍体细胞或单倍体细胞(如同种的精子)荧光强度对比,判断被检查细胞群体的倍性组成。
(2)显微荧光测定法
将被测材料用固定液固定后,将组织用细胞匀浆仪弄碎,使细胞游离,制成涂片标本,或者采取血液制成血涂片。标本用DAPI染色,然后在显微分光光度计上,通过波长365nm的紫外线照射,用扫描测光装置测定细胞核的荧光强度,获得处理组个体和对照组个体之间细胞核DNA相对含量曲线,从而测出二者的DNA比率,即可确定处理组个体的倍性,进而计算出三倍体的诱发率。
46、雌核发育和雄核发育的人工诱导有什么应用价值?(每小项1.5分)
答案：
1、雌核发育的应用
(1)异育银鲫
在用兴国红鲤为父本、方正银鲫为母本的杂交实验中,人们发现异源精子不仅能刺激银鲫雌核发育,而且还能影响子代的生长、性比、体色等性状,故而把这种表现出异源精子生物学效应的雌核发育称之为异精雌核发育。银鲫异精雌核发育的子代统称为异育银鲫。异育银鲫具有明显的生长优势,已在全国许多地方推广并取得了较高的经济效益。
(2)快速建立纯系
在人工雌核发育中,阻止第一次卵裂产生的雌核发育二倍体,由于所有的基因都处于纯合状态,下一代如重复雌核发育即可以产生克隆种群。克隆种群的形成,使过去需要几十年、几百年才能完成的纯系培养,甚至在理论上需要无数次兄妹交配才能完成的完全纯系培育在几年内就可实现,所以在水产动物育种中有着极高的应用价值。
(3)性别控制和单性种群利用
雌性鲤的生长速度要比雄性的快15%-25%,因此,通过培育全雌鲤可以提高产量。
洄游性鲟的鱼籽(雌性生殖腺)有极高的经济价值,养殖全雌鲟的经济效益比雌雄混合群体养殖的要大得多。
由于雌雄对虾个体大小相差悬殊,在养殖群体中如果能够提高雌性对虾的比例,就可以大大提高对虾养殖的产量。
雄性罗非鱼比雌性罗非鱼的生长快得多,且不存在产卵繁殖问题,因此全雄罗非鱼的养殖可直接用于提高产量和产生巨大的经济效益。
(4)确定性别遗传机制
由于水产动物的染色体数量多,个体小,雌雄个体之间难以找到具有形态差异的染色体,更难以确定性染色体,因此要确定性别决定机制是属于雌性同配还是雌性异配颇为困难。采用雌核发育的办法,只需确定雌核发育子代的性别即可得知。
(5)基因一着丝点作图
在人工诱导的雌核发育中,通过计算杂合后代在群体中的比例,就可以推算基因重组频率,根据基因重组频率可以确定基因在染色体上的位置及基因间的距离,从而能绘制基因连锁图。
2、雄核发育的应用
(1)濒危物种保护
精子的冷冻保存比较容易,在有些种类已经达到实用化阶段。如果能够由精子生产出个体,对于濒临灭绝的种类,就不再需要以个体或胚胎的状态保存,而可以以精子的形式进行半永久保存。即使在精子的保存期间,该种不幸灭绝,也可以借近缘种的卵使该种复活。因此,精子冷冻和雄核发育技术相结合,将成为物种保护的重要手段之一。
(2)全雄生产
培育全雌或全雄的单性群体是水产动物育种学研究的重要课题。利用性转换技术和雌核发育技术,全雌鱼生产已经变成了现实。另一方面,利用雄核发育技术,由Y精子诱导雄核发育得出的个体成为YY超级雄性,YY超级雄鱼与正常的雌性(XX)交配子代全成为雄性(XY),进而实现全雄生产。
(3)克隆
遗传上完全均一的生物的生产,无论是作为试验动物还是作为有用性状的固定方法,都是极为重要的。抑制第一次卵裂得到的雄核发育二倍体为完全纯合体,成熟后如果用雄性诱导雄核发育二倍体,用雌性诱导雌核发育二倍体,就可以得到克隆群体。
(4)有害隐性基因的排除
有害隐性基因在与正常基因处于杂合体时不表达,因此将其从某一群体中完全去除比较困难。但是,如果诱导出雄核发育完全纯合个体,有害隐性基因就会全部表达出来。当有害程度比较强时,将成为致死性,而被自然淘汰掉。
(5)核质杂种
借用异种卵子由精子生成个体,就会在精子供体和卵子供体之间形成核质杂种。以往这样的杂种都是通过卵子的去核和核移植的显微手术获得。利用雄核发育技术,不需要显微操作就可以实现核质杂种的大量生产。核质杂种不仅可以用于基因表达、细胞质遗传等研究,对于水产动物育种也具有重要意义。
47、影响鱼类性转变的因素有哪些?(每项5分)
答案：
1、激素与性转变
脊椎动物遗传性别的形成先于生理性别,从遗传性别到生理性别的形成是一个复杂的过程。在这个过程中,遗传基础起了重要的作用,控制性别发育的方向,然而当环境或其他因素产生变化,就有可能影响个体性别发育的方向。环境因素主要通过生理的途径影响激素的种类和激素的量来影响性腺的发育。
雄激素能够诱导雄性化,雌激素可以诱导雌性化。生理性的性反转可能是通过基因对激素的产生进行调控而完成。
2、环境与性转变
尼罗罗非鱼和奥丽亚罗非鱼在高温(34~37℃ )时,产生较高的雄性率,而莫桑比克罗非鱼则在低温(19或20℃)时能增加雄鱼的比例。
丝鳍花酯“社会控制”：一般20尾左右一群,每群有一尾雄鱼,其余都是雌的。当移走雄鱼后,则剩余的最强健的一尾雌鱼会发生性转变,成为雄鱼。如此继续移走雄鱼,则最后一尾雌鱼都会变成雄鱼。
3、性转变机制
神经内分泌途径可能是外部刺激与性转变的内在变化之间的一座桥梁。
48、经常采用的人工诱导多倍体形成的手段有哪些?(每项5分)
答案：
1、物理学方法
(1)温度休克法
冷休克法：其原理是低温能够阻止微管蛋白聚合成微管,从而阻止纺锤丝形成;纺锤丝被破坏以后细胞不能正常分裂,极体不能形成和排出,由此可获得二倍体的卵核,将其与单倍体的精子受精即可获得三倍体。温度休克可以在第一次减数分裂期间(目前的技术只适用于某些无脊椎动物)进行(抑制第一极体的排出),也可以在第二次减数分裂中进行(抑制第二次减数分裂)。无论抑制哪一个极体的排出,均需要准确的处理时间,也就是减数分裂的中期,纺锤丝形成前和形成期间进行温度处理才能保证效果。
热休克法：若正在进行减数分裂的卵细胞处于较高温度环境中, 细胞内一些进行生命活动的重要酶类如ATP酶就会遭到破坏,从而使供能途径受阻,纺锤体不能形成,进而抑制了细胞的分裂,极体不能排放,形成二倍体的卵原核,与正常精子受精即形成多倍体。热休克处理的时间必须刚好在减数分裂的中期以前及中期分裂纺锤丝形成期间。
(2)静水压处理
将处于第一或第二成熟分裂期的鱼卵采用较高的水静压处理(大约为65Okgf/cm2),微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性,发生可逆性裂解,破坏纺锤丝的形成,从而破坏了细胞分裂,抑制了第一或第二极体的排出,导致二倍体卵子的形成,进而与正常精子受精得到三倍体;当水压力的变化发生在第一次卵裂时,由于破坏了二倍体体细胞的纺锤丝的形成,导致类似于核内有丝分裂的现象发生则可能产生四倍体的个体。
(3)电脉冲休克
在一定的电场条件下,细胞与细胞之间的膜会发生融合,导致两个细胞合二而一,从而诱发多倍体(四倍体)。
2、化学方法
(1)秋水仙素
是从百合科植物秋水仙的种子、鳞茎中提取的生物碱,能抑制微管的组装,使已有的微管解聚合,阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体,从而导致核内有丝分裂形成多倍体细胞。在去除秋水仙素后,其作用立即结束,细胞恢复正常的生理状态。
(2)细胞松弛素
真菌的一类代谢产物,是水产动物育种中是最常用的一种化学诱导药物。CB特异性破坏微丝,最终导致控制细胞分裂的由微丝构成的收缩环的解体,抑制细胞质分裂,阻止极体的释放,从而产生多倍体。
(3)聚乙二醇
是一种常用的细胞融合剂,能使细胞发生融合,从而使染色体加倍。该药物被广泛用于试管内的细胞融合。由于其特殊的理化特性,也将其用于水产动物的多倍体诱导。
(4)6-二甲基氨基嘌呤
是嘌呤霉素的一种类似物,其生理作用是抑制蛋白质磷酸化,通过作用于特定的酶,破坏微管的聚合中心,使微管不能形成,从而破坏细胞分裂,抑制卵细胞极体的形成和释放。6-DMAP非致癌性,具水活性。洗除该药物后,受精卵可以正常发育。6-DMAP低毒、高效、价格便宜,在诱导多倍体方面表现出较大的优越性和较广阔的应用前景。
(5)咖啡因
进人细胞后可以立即提高细胞内的Ca2+浓度。由于微管对Ca2+浓度敏感,当Ca2+浓度极低或高于1mg/mL时,会引起微管二聚体的解聚,阻止细胞分裂,从而形成多倍体。
3、生物学方法
(1)远缘杂交
亲本配子染色体加倍可以使染色体达到平衡,从而克服远缘杂交的困难获得多倍体的杂交种。因此,远缘杂交可以产生异源多倍体。
(2)核移植及细胞融合
核移植诱导鱼类多倍体技术仍处于实验阶段,试管内的细胞融合可以产生多倍体细胞。
(3)四倍体与二倍体交配生产三倍体
目前对三倍体诱导的大量工作表明:很难有一种方法能产生100%的三倍体,且操作烦琐,每年进行诱导培育,使用昂贵的仪器,所用药品毒性大、价格昂贵,生产成本较高。
49、结合本地实际情况,简述生物入侵的危害?(每项5分)
答案：
1.对物种的影响
生物人侵者对被人侵地的其他物种以及物种的多样性构成威胁。根据联合国粮农组织统计,生物人侵已使数以千计的土著物种灭绝。
2.对生态环境影响
生物多样性是人类赖以生存和发展的物质基础,地球上的生物多样性每年为人类创造约33兆亿美元的价值。然而,近年来生物多样性受到了严重威胁,物种灭绝速度不断加快,遗传多样性急剧贫乏,生态系统严重退化，这些都加剧了人类面临的资源、环境、粮食和能源危机。而外来物种对生态环境的入侵已经成为生物多样性丧失的主要原因之一。
3.对经济上的影响
首先是潜在的经济损失,即农作物、家畜和渔业对象存活、疾病防治和产量的减少造成的经济损失。然后是入侵的直接损失,包括检疫、控制和根除等方面的花费。第三是威胁人类健康的损失,因为有些人侵生物是导致疾病的直接因素或致病寄生虫的载体或携带者。
50、试述核移植的方法 (答全要点给满分，答不全按4分/项给分)
答案：
(1)核供体细胞的制备：受精后已发育到高囊胚或低囊胚的鱼卵去膜后，置于底部涂有琼脂，并盛有Holtfreter氏液的培育皿中，置于解剖显微镜下，用玻璃针\发圈切下位于动物性极的囊胚细胞团，这些细胞在2-3分钟内能分散成游离细胞。如果细胞暂时分不开，可用一支细吸管吸水后轻轻冲击它们，以帮助细胞分离。
(2)受体细胞的制备：移核前，鱼卵需先去膜。最常用的方法是用磨尖的不锈钢镊子在解剖镜下剥开卵膜，游离出卵子。剥膜应于排卵后2-3分钟，在盛有消毒水的培育皿中进行。剥粘性卵时，一般只需一手持镊，用镊尖夹住卵膜的一处，迅速把膜撕裂，裂口越大越好;剥浮性卵时，卵膜吸水后膨胀，卵周隙很大，所以可用双手持镊，同时夹住卵膜上的一处，迅速把卵膜向外撕裂。
(3)移核：将分离的的囊胚细胞立即用吸管移至盛有去核卵的培育皿中内备用。移核时，把盛有去核卵和分离细胞的培养皿置于解剖显微镜下，用发圈将它们拨到视野内，然后将操纵台移近解剖显微镜的一侧，调节移动上的位移旋钮和微型吸管的角度，使之对准分离的囊胚细胞，轻轻向后旋动注射器上的微分筒，该细胞随培养液被吸入管内破裂，但细胞质不能分散，应仍紧包围着其中的细胞核，否则细胞核直接与液体接触会受损伤。细胞被吸入管内的位置，以刚进行管口一小段距离为宜，以免将它注入卵时带入过多的培养液。
(4)核质杂种的培养：鱼类核移植杂种细胞由于卵外胶膜被破坏，需在等渗的Holtfreter液中培养一段时间，然后逐渐转入低渗溶液，早期胚胎发育过后可入曝气水中培养。
