【摘要】：块菌是一种具有良好的药用价值的大型食用真菌。野生块菌来源稀少,无法满足现在的市场需求,液态发酵是获得高产量、低成本块菌菌丝体的有效途径。在块菌液态发酵过程中合成的次生代谢产物皂苷有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性。但是,目前对块菌皂苷的研究是非常有限的。本文以主要对黑胞块菌(Tuber melanosporum)液态发酵为研究对象,通过添加芦丁的策略增加其胞外皂苷的合成,优化块菌发酵培养基成分和培养条件以提高皂苷产量及其抗氧化活性,结合转录组学技术解析芦丁调节块菌合成皂苷的机理,并进行了块菌液态发酵的反应器放大。主要结论如下:(1)通过培养基成分和培养条件的正交设计实验优化,确定了块菌液态发酵产皂苷的最佳培养基组分和摇瓶培养条件。其中,最佳培养基组分为芦丁4.8g/L、葡萄糖43.5 g/L、蛋白胨6 g/L、NH_2PO_4 1.15 g/L、Na Cl 0.2 g/L、VB_2 0.082g/L、VB_6 0.1 g/L、VC 0.02 g/L;最佳培养条件为p H 5.7,接种量12.5%(v/v),24℃,190 rpm,4天。在此最优发酵条件下,皂苷产量高达0.413 g/L,较未优化的块菌皂苷产量增加了134.7%,添加芦丁可使块菌皂苷产量较未添加芦丁提高50.2%。

块菌皂苷RTS(加芦丁)和TS(不加芦丁)具有抗氧化活性,RTS和TS的DPPH·自由基最大清除率分别为93.98%和76.88%,OH·自由基清除能力分别为79.26%和68.83%,最大铁还原抗氧化能力分别为42.22 m M和38.57 m M。培养基中添加芦丁之后,块菌菌丝细胞膜膜透性增加,细胞壁厚度减小,这可能是芦丁提高块菌皂苷产量的原因之一。(2)差异基因的GO功能富集显示,与不添加芦丁的对照相比,添加芦丁组差异基因主要显著富集于分子功能,表明添加芦丁对块菌生物过程、细胞组分相关基因的影响比较小,对分子功能的影响较大。差异基因进行KEGG富集分析的结果表明,添加芦丁组差异基因主要显著富集于真核生物核糖体的生物合成,嘧啶代谢,嘌呤代谢和特定氨基酸的代谢。添加芦丁组的多糖和皂苷合成途径大部分相关酶基因均上调,表明芦丁的添加可促进块菌多糖和皂苷的合成代谢。(3)在5 L机械搅拌反应器中进行块菌液体发酵的放大培养,块菌皂苷和多糖的合成在150 rpm,1.4 lpm条件下达到最大值,分别为0.48 g/L和14.44 g/L。比较不同搅拌转速条件下块菌菌体形态与多糖及皂苷产量的关系,可以发现表面光滑、较大的菌球液态发酵合成多糖和皂苷的产量较低,较小的、分散均匀且表面有较长菌丝的的菌球液态发酵合成多糖和皂苷的产量较高;比较不同通气量条件下块菌菌体形态与多糖及皂苷产量的关系,在较低的通气量情况下(1.4 lpm),菌球的数量比高通气量下小,菌球直径与高通气量下无区别,但是发酵合成皂苷和多糖的产量最高。高搅拌速度和低通气量条件下,细胞膜通透性提高,细胞壁厚度减小,这可能与高剪切力和低溶氧的外界环境胁迫有关。