本发明涉及药物分析及中药鉴定领域，尤其涉及一种天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法。
背景技术：
天然麝香是一种极为名贵的中药材，它具有开窍醒神、活血通络、消肿止痛等功效，用于治疗热病神昏、中风痰厥、痛肿瘰疬、跌扑伤痛等常见病、多发病和疑难病症，已有2000多年悠久的药用历史，在中华民族的医疗保健史上发挥了长期、重要的作用，不仅如此，天然麝香还可用于制造高档香料。
麝香产于雄性麝属动物的香囊腺中，是成熟雄麝香囊中的干燥分泌物，传统中医药中使用的主要是林麝麝香。林麝为国家一级保护动物，随着国内野生林麝数量的减少，近年来林麝麝香产量急剧下降，目前国内天然麝香的生产主要依赖人工饲养林麝，但其需求与保有量很不均衡，导致国内天然麝香极为紧缺，麝香在市场上供不应求，价格也逐年上涨。在此背景下，国外各种麝香，尤其是俄罗斯麝香开始走私进入国内冒充林麝麝香销售，相比林麝麝香，俄罗斯麝香产量大、价值低，大规模的仿冒行为严重扰乱了国内麝香市场正常秩序，同时对国内养麝业也产生了不利的影响。
另一方面，俄罗斯麝香的药理活性远远不及林麝麝香，以仿冒林麝麝香的俄罗斯麝香入药，会显著降低药效，对患者疾病的治疗极为不利。
然而，由于俄罗斯麝香从外观、颜色及气味上与林麝麝香极为相似，通过外观、颜色、气味等性状鉴别很难将其与林麝麝香区别开来，这也正是俄罗斯麝香之所以能够大行其道的重要原因。
目前鉴别俄罗斯麝香主要是在麝香尚未从香囊腺取出前，通过观察香囊腺外观来判断是否为俄罗斯麝香，然而一旦麝香从香囊腺中取出后，就极难对其原始来源作出准确的判断了。
也有学者提出了通过显微镜观察法鉴别国产林麝麝香及俄罗斯麝香的方法(傅颖等，麝香真伪的现场快速显微鉴别，药物分析杂志，2012，32(4)：706-708)，但由于在显微镜下林麝麝香与俄罗斯麝香外观形态的差别并不明显，因此显微镜观察法的检测准确性尚有待提高，且显微镜观察法需要经受过长期训练的专业人员来操作，对操作人员的专业水平和实践经验要求较高，其观察结果的判定易受到观测人员主观因素的影响，因此难以推广使用。
本发明提供了一种天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法，探索出了一套原料预处理工艺和相应的气质联用(gc-ms)色谱分析条件，通过对俄罗斯麝香和林麝麝香的gc-ms图谱进行对比分析，利用两种麝香的图谱差异确定俄罗斯麝香的gc-ms图谱特征，从而能够方便快速的进行天然林麝麝香和俄罗斯麝香的分析判定。由于本发明方法具备确定的操作规范和操作条件，受试验人员主观因素影响小，其结果的准确性和可靠性远远高于显微观测法，且本发明方法简便易行、对操作人员的专业水平和实践经验要求不高，非常适宜于在药物检测领域推广使用。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种简便易行的天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法，本发明方法包括以下步骤：
(1)样品预处理：将待检测的天然俄罗斯麝香用预冷到-50℃的冷冻干燥机冷冻干燥12-24h，得到天然俄罗斯麝香冻干粉，称取上述天然俄罗斯麝香冻干粉0.05g，用无水caso4吸水干燥72h，然后加入1ml二氯甲烷萃取10-30min，过滤后取萃取液100μl作为天然俄罗斯麝香供试品，采用同样的方法处理天然林麝麝香标准品得到天然林麝麝香供试品；
(2)气质联用gc-ms色谱分析：将上步取得的两种供试品分别注入气质联用分析仪进行gc-ms分析，色谱条件如下：
进样口温度：280-282℃；
转接口温度：290-292℃；
管柱温度：60℃，保持5分钟，
之后每分钟增加10℃直至150℃，保持5分钟，
之后每分钟增加5℃直至280℃，保持5分钟；
柱压：49-50kpa；
柱流速：0.9-1.0ml/min；
线速度：34-35cm/min；
流量：3-3.2ml/min；
分流比：10：1；
载气：氦气；
载气流速：1-1.05ml/min；
(3)数据处理：获取天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香gc-ms色谱数据后，分析比较两种麝香的gc-ms图谱，找出两种麝香色谱峰的差异，对差异峰进行质谱分析，对化学物质进行鉴别，通过对比两种麝香所含麝香酮特征峰的显著差异比较区分天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香。
优选地，本发明方法包括以下步骤：
(1)样品预处理：将待检测的天然俄罗斯麝香用预冷到-50℃的冷冻干燥机冷冻干燥18h，得到天然俄罗斯麝香冻干粉，称取上述天然俄罗斯麝香冻干粉0.05g，用无水caso4吸水干燥72h，然后加入1ml二氯甲烷萃取15min，过滤后取萃取液100μl作为天然俄罗斯麝香供试品，采用同样的方法处理天然林麝麝香标准品得到天然林麝麝香供试品；
(2)气质联用gc-ms色谱分析：将上步取得的两种供试品分别注入气质联用分析仪进行gc-ms分析，色谱条件如下：
进样口温度：280℃；
转接口温度：290℃；
管柱温度：60℃，保持5分钟，
之后每分钟增加10℃直至150℃，保持5分钟，
之后每分钟增加5℃直至280℃，保持5分钟；
柱压：49.5kpa；
柱流速：0.9ml/min；
线速度：34.7cm/min；
流量：3ml/min；
分流比：10：1；
载气：氦气；
载气流速：1ml/min；
(3)数据处理：获取天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香gc-ms色谱数据后，分析比较两种麝香的gc-ms图谱，找出两种麝香色谱峰的差异，对差异峰进行质谱分析，对化学物质进行鉴别，通过对比两种麝香所含麝香酮特征峰的显著差异比较区分天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香。
图谱分析表明，在分析的30份天然俄罗斯麝香样品中，全部缺失麝香酮物质特征峰，而天然林麝麝香全部含有麝香酮特征峰。
利用面积归一化法分析两种麝香中麝香酮含量数据，在分析的30只俄罗斯麝的麝香样品中麝香酮缺失，麝香酮含量全为0，而分析的30只林麝的麝香样品中都含有麝香酮，麝香酮成分含量在7-14％之间。
此外，本发明还涉及一种天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法在药物检测中的应用。
由于麝香价格昂贵，因此微量鉴定方法更具实用性，本发明通过改进原料预处理工艺，在原料提取过程中引入了冷冻干燥步骤，在提高干燥效率的同时抑制了麝香中挥发性成分的散失，使样品标志性成分的提取效率大大提高，具备了微量检测的可能性。此外，由于本发明方法具备确定的操作规范和操作条件，受试验人员主观因素影响小，其结果的准确性和可靠性显著提高，且本发明方法简便易行、对操作人员的专业水平和实践经验要求不高，非常适宜于在药物检测领域推广使用。
附图说明
图1为天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香样品的gc-ms色谱图(图中箭头所指为麝香酮特征峰位置)。
图2为天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香样品的麝香酮含量差异图(其中俄罗斯麝香不含麝香酮，林麝麝香麝香酮含量范围在7-14％之间)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例
一种天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：将待检测的天然俄罗斯麝香用预冷到-50℃的冷冻干燥机冷冻干燥18h，得到天然俄罗斯麝香冻干粉，称取上述天然俄罗斯麝香冻干粉0.05g，用无水caso4吸水干燥72h，然后加入1ml二氯甲烷萃取15min，过滤后取萃取液100μl作为天然俄罗斯麝香供试品，采用同样的方法处理天然林麝麝香标准品得到天然林麝麝香供试品；
(2)气质联用gc-ms色谱分析：将上步取得的两种供试品分别注入气质联用分析仪进行gc-ms分析，色谱条件如下：
进样口温度：280℃；
转接口温度：290℃；
管柱温度：60℃，保持5分钟，
之后每分钟增加10℃直至150℃，保持5分钟，
之后每分钟增加5℃直至280℃，保持5分钟；
柱压：49.5kpa；
柱流速：0.9ml/min；
线速度：34.7cm/min；
流量：3ml/min；
分流比：10：1；
载气：氦气；
载气流速：1ml/min；
(3)数据处理：获取天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香gc-ms色谱数据后(参见附图1)，分析比较两种麝香的gc-ms图谱，找出两种麝香色谱峰的差异，对差异峰进行质谱分析，对化学物质进行鉴别，通过对比两种麝香所含麝香酮特征峰的显著差异比较区分天然俄罗斯麝香和天然林麝麝香。
图谱分析表明，在分析的30份天然俄罗斯麝香样品中，全部缺失麝香酮物质特征峰，而天然林麝麝香全部含有麝香酮特征峰(参见附图1)。
利用面积归一化法分析两种麝香中麝香酮含量数据，在分析的30只俄罗斯麝的麝香样品中麝香酮缺失，麝香酮含量全为0，而分析的30只林麝的麝香样品中都含有麝香酮，麝香酮成分含量在7-14％之间(参见附图2)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
技术特征：
技术总结
本发明涉及药物分析及中药鉴定领域，尤其涉及一种天然俄罗斯麝香与天然林麝麝香的微量鉴定方法。本发明方法包括样品预处理、气质联用GC‑MS色谱分析和数据处理步骤，通过对俄罗斯麝香和林麝麝香的GC‑MS图谱进行对比分析，利用两种麝香所含麝香酮特征峰的显著差异，以及对两种麝香所含麝香酮含量分析数据的比较确定为何种麝香，从而能够方便快速、准确的进行天然林麝麝香和俄罗斯麝香的分析判定。由于本发明方法具备确定的操作规范和操作条件，受试验人员主观因素影响小，其结果的准确性和可靠性显著提高，且本发明方法简便易行、对操作人员的专业水平和实践经验要求不高，非常适宜于在药物检测领域推广使用。
技术研发人员：刘树强;于娟;李旭鑫;李依蒙;张天祥;范梦圆;张美善;孙晓宁;齐磊;黄志鑫;林绍碧;胡德夫
受保护的技术使用者：北京林业大学;漳州片仔癀药业股份有限公司
技术研发日：2017.10.11
技术公布日：2018.01.09
