今年AACC杂志第7期，刊登了一篇重要文章。长期来肌钙蛋白检测产品中，经常在讨论出现心肌梗死后，从心脏释放到血液里的cTnI或cTnT分子，除了完整的分子外，还有被蛋白水解后的片段；而且这些片段有多个表现。使得肌钙蛋白检测的可靠性带来的疑问。这篇文章专门对心肌梗死后病人血液内的cTnI的分子情况进行了详细的分析。对形成一个检测方法如何选择抗体提出了方向。还有，非常难得的是，这篇文章除了是HyTest公司人员外，俄罗斯实验室的研究人员也共同参与了研究。我将文章进行了一些摘译。供大家参考。

在急性心肌梗死病人血液中完整大小的心肌肌钙蛋白I和它的蛋白水解片段：为形成检测选择抗体。

背景

在急性心肌梗死（AMI）的病人血液中，心肌肌钙蛋白I（cTnI）展现为一个完整分子和全部蛋白水解的片段。cTnI的降解会负面地影响它的精确免疫检出。在本研究中，我们证实了cTnI的片段，并计算了病人血液中在AMI后不同时间时它们的比率，以辨别cTnI的最稳定部分。

方法

AMI病人出现胸痛后，在安装支架前后的1到36小时内收集系列血清样品。在系列样品内片段的比率，对血清样品中进行免疫提取，以cTnI不同决定簇特异的单克隆抗体（mAb）进行免疫印迹分析，并以2个自制的对cTnI中心部分和末端部分特异的免疫检测方法进行检测。

结果

在AMI病人血液中检出了完整的cTnI和它的11个主要片段。在系列样品中片段的比率没有显示在AMI的1~36小时后有很大的变化。对位于大致上在氨基酸末端（aar）34和126的决定簇特异的mAb，对所有提取的cTnI进行了染色。对aar23-36和126-196特异的mAb，识别了约80%到90%（表现为丰富的）的cTnI。

结论

除了对cTnI中心部分特异的mAb外（大致上aar34-126），对邻近的决定簇特异的抗体（大致上aar23-36和126-196）可以用于检测，因为它们识别了AMI后第一个36小时内，病人血液样品内≥80%的cTnI。

讨论

在免疫检测中，使用mAb对分析物可劈开的区域的检测，会低估样品中分析物浓度，对一些病人或病人组有错误诊断的潜在性。早期研究显示了cTnI的N-端和C-端部分（大致上为aar1-30和110-210）是易于被降解的，建议了使用对这些不稳定片段特异的抗体有明显的局限性。但是，在几个研究中，展现了大多抗体识别了“稳定的”中心决定簇的，却对一些病人血液中存在的自身抗体敏感。这样的自身抗体干扰了检测的mAb，可负面影响cTnI的检测，有些情况下（早期样品或小面积AMI），这个干扰或导致假阴性结果。很明显，这2个因素影响了cTnI的精确检测 --cTnI降解和自身抗体-- 研究者为cTnI检测选择抗体上已经困惑了许多年。近期研究的目标是，分析AMI病人血液中，cTnI的蛋白水解片段的组成和发生率，了解是否mAb对cTnI的非aar30-110其他区域特异的，可以用于cTnI检测，没有显著低估分析物浓度或得到假阴性结果的风险。

我们对AMI病人血清样品的免疫印迹研究，说明了在不同病人、以及在不同时间收集的血液样品，具有cTnI片段的相似图谱。使用已知决定簇特异性的mAb，我们可以证实和建立cTnI的11个蛋白水解片段的氨基酸范围，不在分子的N-端或C-端。这些数据是从血液中提取的cTnI得到的，与我们以往发表的体外研究有很好的一致，我们曾分析了心肌组织中cTnI的降解。对aar34-126特异的抗体识别了从AMI病人血液中提取的所有免疫活性的cTnI形式。

为确保以免疫印迹分析可靠地检出低含量的cTnI片段，我们分析了具有相对较高的cTnI浓度的样品（约1~200μg/L）。除了cTnI浓度较宽外，我们没有观察到分析样品中cTnI片段分布有任何主要的差异。我们推测，在浓度低于1μg /L的样品中，cTnI片段的比率也没有显示重大的差异。

我们没有能检出小于14kD的任何片段。我们使用的技术可检出小于质量1~2kD。我们推测，cTnI片段小于30~130aar的，会没有了结合到cTnC的能力（cTnC预防了cTnI来自蛋白水解酶解调的降解），而且，或是在坏死组织和/或血液中的快速降解到非常小的片段，不能被mAb识别；和/或在它们被释放到血流循环中去除了。

早期的体外研究心肌组织内cTnI降解中，我们观察到完整大小的分子随时间逐渐降解，它的大片段到小片段，分子量为14~18kDa。以后cTnI的降解，McDonough等观察了心脏搭桥病人的心肌活检样品；以及Medsen等观察AMI病人在灌注后的不同时间血清样品。依据这些发现，很长时间被认为，cTnI主要以完整分子存在于早期血液样品中，逐步被大的片段取代，最后大致在aar30~110或甚至更小片段取代。

没有预料到与体外研究相反，我们的研究没有观察到在完整大小的cTnI分子和它的片段比率的重大变化，在安装支架前后的血液样品中，在出现AMI症状的2~36小时内以2个独立方法检测：免疫印迹和FIA。完整大小的cTnI和它的片段在血液中的比率，随时间没有明显改变。

依据这些观察，我们建议发生cTnI的降解主要是在AMI病人的坏死的心肌，不是在血液中。缺血的心肌中细胞的死亡是一个连续的过程，它看来只要心肌细胞和它们的收缩装置达到了一些降解临界水平，cTnI和它的片段从肌丝冲洗进入血液。因为降解/冲洗出去的这个平衡、血液中完整大小的cTnI和它的片段，依然几乎没有随时间变化。早期直接安装在心脏肌肉的缺血部分的血液中的支架，防止了心肌组织的进一步坏死，以及更深远的cTnI降解。但是，我们不排除，如果安装支架较晚，可能会导致从“核心”坏死区域cTnI的较小片段有大得多的量被释放出来，原先该区域在灌注前被限制进入血液。我们也需要注意的是，本研究我们已经分析的仅为AMI病人样品，所以我们不能确信，cTnI片段的分布，会与其他疾病病人样品内一样，这些疾病影响了心肌或来自血流对cTnI的清除。（即，慢性心衰、胸部受伤、心肌的毒性伤害、慢性肾病等）。

我们的结果否定了由Madsen等研究的结果，他们认为在再灌注后的第一个90min内采集的样品内，才能检出完整大小的cTnI；在安装支架后的第一个90~120min内逐渐出现cTnI的蛋白水解片段；同时伴随样品中cTnI浓度的升高从＜1到＞100 μg/L。但是以后，没有观察到在片段比率上有实在的变化。我们可推测，在安装支架后的第一个90 min期间采集的样品内缺乏蛋白水解的片段，可以被解释为在印证研究中使用的检测系统缺少灵敏度，它不能染色cTnI片段，因为在早期样品中分析物浓度很低。Madsen等以后工作的结果普遍地确认了本研究中展现的结果，由于这些作者即使在经皮间隔消融术后的50 小时，还观察到相当量的完整大小cTnI和它的高分子量的片段。

对位于23~196氨基酸残基决定簇特异的抗体可识别病人样品中＞80%的cTnI，在AMI后的36小时内，它们的比率没有很大的改变，这个实用观点很重要。尽管片段由aar 30~110组成，被早先建议为检测抗体的靶向，相当大（约为cTnI分子的三分之二），它的主要部分负责TnC和cTnT的结合。大多抗体对游离cTnI分子aar 50~80和90~130区域特异的，难以识别二元IC或三元ITC复合物中的cTnI。所以，仅位于cTnI最稳定片段很少的决定簇，可以被用作抗体形成的靶向。我们近期研究显示了，利用对aar 23~40和140~196区域特异的mAb的检测方法，能检出＞70%~90%的cTnI和它的片段（每个成对抗体识别＞80%的蛋白），即使在相对较晚的样品。同时，这些mAb在自身抗体存在下几乎是不敏感的，所以，几乎总体上排除了血液检测表现的假阴性结果。为形成检测选择这样的抗体，可合理地解决cTnI检测中2个主要的缺点：cTnI蛋白水解降解的阴性干扰，和抗-cTnI自身抗体的阴性干扰。

本研究，我们展现了存在于AMI病人血液中的cTnI，呈完整大小的分子和11个蛋白水解片段。完整大小的cTnI与它的片段比率在AMI症状后的1~36小时期间没有非常大的改变。在病人血液中存在的cTnI最稳定部分，大致上被aar 34~126区域划分；对aar 23-196区域内的决定簇特异的抗体，可识别＞80%所有免疫活性的cTnI。利用对cTnI的aar 23~40和/或14~196区域特异的抗体，会是一个良好的妥协方案，在免疫检测精确的cTnI检测上，可帮助消除蛋白降解的阴性影响和自身抗体的干扰。