核心提示：(一）核酸内切酶检测方法：把3ml底物(含0.04mg小牛胸腺DNA，用0.2mol/LpH5.0醋酸钠缓冲液配制）和1ml酶(大约20mg的蛇毒)混在一起，放入37C保温的分光光度计比色杯中，以水作为空白，底物作对照
(一）核酸内切酶
检测方法：
把3ml底物(含0.04mg小牛胸腺DNA，用0.2mol/LpH5.0醋酸钠缓冲液配制）和1ml酶(大约20mg的蛇毒)混在一起，放入37C保温的分光光度计比色杯中，以水作为空白，底物作对照，在A26。胃和A33tom处变换着测定并记录，直到A33teni处的数值开始大幅度地增加为止，然后以A2_m测得值对时间作图。若还没有得到足够的点去确定直线时，A33Qmn处的数值就大幅度增加，必须用再稀释一些的毒液重新测定。用1:75〜1:110的稀释液一般能获得满意的结果，因为在这种条件下，A33_的值在lh〜2h内能保持相对的稳定。核酸内切酶的1个酶单位被定义为lmin内，在260nm处增加1个吸收值所需的酶量。
(二）磷酸二酯酶
方法一(Bjork等，1963)
原理:双-对硝基苯磷酸钙经磷酸二酯酶水解后产生对硝基苯磷酸，后者在碱性条件下，在400nm处有吸收峰。
操作过程:反应液含1.0ml0.lmol/LpH8.9的Tris-HCl缓冲液，1.2ml0.OOlmol/L双-对硝基苯磷酸钙和0.2ml酶液，加水到3ml,在37°C下保温。保温一定时间后，加入3ml0.05mol/LNaOH停止反应，在400nm处测定吸收值，对照不加酶液。把每分钟释放1/rniol对硝基苯酚的酶活定为1个酶单位。
2.方法二（Bessen，1946)
反应系统组成如下:5mg/ml蛇毒溶液配在含有1.2Xl(T2mol/LMgCl2的0.05mol/L甘氨酸缓冲液(pH8.8)0.2ml中。
双-对硝基苯磷酸二钠或双-对硝基苯磷酸钙(配在上述溶液中，调pH为8.8)1.0ml，反应总体积1.2ml。在37°C保温5min〜40min后，加10ml0.02mol/LNaOH停止反应，在420nm处比色，测定对硝基苯酚的生成。
3.方法三（Razzell，1963)
该法除用对硝基苯胸腺嘧啶5'-磷酸为底物代替双-对硝基苯磷酸钙外，其他地方和上述两种方法相似。反应液含lOOfxmolpH8.9的Tris-HCl缓冲液，0.5/xmol底物，总体积为lml。在加待测试液前，混合液应在37€水浴中平衡，加酶液后立即在400nm处测吸收值。每分钟水解ljumol底物相当于1.2个酶活力单位。
(三）核甘酸酶
方法一（Hepper法，1955)
5'-核苷酸酶、腺三磷酶、腺二磷酶和核苷焦磷酸酶活力都可以用Hepper法测定。反应系统组成如下:5mg/ml〜15mg/ml蛇毒溶液〔配在含有1.2X10_2mol/LMgCl2的0.05mol/L甘氨酸缓冲液0.2ml中(pH8.8)〕，3.6X10-2mol/L5'-UMP，或ATP，或ADP，或辅酶I(用上述缓冲液配制，调pH到8.8)1.0ml,反应总体积1.2ml。在37°C保温2h后加lml10%三氯乙酸停止反应，放置20min,过滤，取滤液lml按Fiske-Subbarrow(1956)方法测定无机磷的生成，在660nm比色。
方法二(Suzuki法，1958)
反应液含0.lml4;xmol5'-AMP，0.lml0.3mol/LMgCl2,0.5ml0.2mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(PH8.5)和0.2ml酶液，总体积为0.9ml。在37'C下保温15min，释放的无机磷用Allend法（1940)测定。
除上述方法以外，还可以用以下方法测定5'-核苷酸酶的活性:①用纸层析法测定由底物水解产生的腺苷的放射活性，这种方法需把底物腺苷酸AMP进行放射标记(Murray等，1969);②在腺苷脱氨酶的存在下，用分光光度计测定腺苷转变成次黄嘌呤核苷的速度(Ipata，1967);③也可以测定②中氨的产生量(Belfield等，1970;Bootsma,1972);④用14C标记AMP，经酶作用后的反应液过氧化铝柱，对分离下来的“C腺苷进行放射测定，未被作用的底物被吸附到柱子上。
(四）酸性磷酸酶
检测方法(Tu等，1966):
这种方法是在H0fstee(1954)工作的基础上建立的。对照和测定管中都加0.5ml0.0036mol/L的邻-羟苯基磷酸。对照管中加2.0ml0.15mol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液和0.5ml去离子水，总体积为3.0ml。这样最终底物浓度为0.6mmol/L，缓冲液的浓度为0.lmol/L，测量管以0.5ml酶液代替去离子水，酶液混合后在25C保温，测定因水解释放水杨酸而产生的在300nm处的光吸收。调整蛇毒浓度，至少可将5min内各测定值和时间作图得出一条直线。把每分钟水解1/umol底物所需的酶量定为1个酶单位。
(五）碱性磷酸酶
1.方法一（Sulkowski等，1971)
用对-硝基苯磷酸为底物，这种物质不被5'-核苷酸酶水解，因而避免了这种酶对测试的干扰。反应液含1.0ml0.lmol/LpH9.5的苷氨酸-氢氧化钠缓冲液，1.2ml的
001mol/L对硝基苯磷酸，0.3ml1.2Xl(T2mol/LMgCl2和0.lml酶液，加水至3.0ml。在37°C下反应15min，加3.OmI0.05mol/LNaOH停止反应，在400nm处以不加酶的样品为对照测光吸收。把每分钟释放1/^nol对硝基苯酚的酶量定为1个酶单位。
除上述方法外，碱性磷酸酶还可以用测定磷酸二酯酶活性的Bessey法测定。
方法二
参考Sigma改良法及Bessey法进行。0.2%PNPP(pH10.3,含Mg2+0.0025mol/L)lml，酶液0.2ml，保温25min(37°C)。加10ml0.02mol/LNaOH终止反应。415nm比色。查对-硝基酚标准曲线并计算酶活力，每个AKP活力单位是上述条件下每分钟使底物水解生成l^g分子对-硝基酚的酶活力。
方法三(AKP同工酶的分离鉴定及其等电点测定）
参照乔克强、Coopei.及Gabrie的方法进行。用7.5%聚丙烯酰胺凝胶做支持物，1%(终浓度)的PH14〜10Ampholine做两性电解质载体进行等电点聚焦电泳。电泳结束后取出凝胶，将之置于蒸馏水中漂洗片刻，然后浸泡于酶染液内在37°C水浴中保温30min。不经漂洗酶带即清楚出现。酶染液组成:在含有25mmol/La-萘酯磷酸钠的33mmol/LpH8.5Tris-HCl缓冲液中按2mg/ml〜3mg/ml加入G.B.C.，充分搅匀后使用。凝胶各节段pH值的确定:在同一条件下完成等电聚焦电泳的多条凝胶中抽取部分进行酶染色，部分凝胶则从正极到负极端按每段0.5cm切断。依次把各节段置于2ml中性蒸馏水中浸泡过夜，测定各节段浸泡液的pH值，并据此绘出整条凝胶从正极到负极端的pH递变图。根据酶带的位置求出各酶带(同工酶)的等电点。
(六）核糖核酸酶
检测方法(McDonald法，1955):
反应系统组成如下：5mg/ml〜8mg/ml蛇毒溶液（配在0.lmol/LTris-HCl缓冲液中，pH7.6)0.2ml，1.0ml7mg/ml酵母RNA溶液（配在上述缓冲液中），反应总体积
2ml。在3(TC保温30min以后，加2.0mlMacFadyeri试剂停止反应，放置30min，过滤，取1.0ml滤液加1.0ml蒸馏水和6.0ml0.2%3,5-二羟甲苯溶液，在沸水浴中加热20min显色，在680nm比色，测定寡核苷酸的生成量。
作用于磷酸酯的酶类水解底物有交叉现象，因此在测定过程中一定要注意其他磷酸酯酶的干扰。例如核酸内切酶、磷酸二酯酶相互间可以产生干扰。5'-核苷酸酶可以干扰磷酸二酯酶的测定。在实验过程中可以通过选择特定底物、特定反应条件等来避免干扰。
(七）对氧磷酶
检测方法(Mende等，1975):
反应液含0.1ml酶液，50u10.lmol/L对氧磷溶液（溶于丙撑二醇）和0.85ml50mmol/LpH7.4的Tris-HCl缓冲液（含5mmol/LCaCl2)，整个反应体系总体积为0ml。在400nm或348nm处记录消光值来测定水解速度(Armstrong等，I%6)。每分钟释放lMm0l对-硝基苯酚的酶量定为1个酶单位。
