通讯作者单位：南京农业大学植物保护学院

实验设计

结果

1美洲大蠊形态变化的观测及肠道H2压力和pH值的测定

环氧虫啶（CYC）是在中国新近开发和注册的一种新型烟碱类化合物，对一系列害虫具有很高的杀虫活性。用CYC处理时，美洲大蠊被拉伸和增厚（图1A），前肠膨胀得非常大（图1B）。形态学变化既是时间依赖性的（图1C，图S1A）也是浓度依赖性的（图1D，图S1B）。CYC处理后形态变化迅速，随时间的推移迅速发展并在30 h达到峰值，体长增加30%，厚度增加35%（图S1）。在吡虫啉（IMI）处理中也观察到美洲大蠊的身体伸展（图1E），这也是时间依赖性和浓度依赖性的（图S2）。

测定了CYC处理的美洲大蠊肠道中H2压力和pH值，并与未处理的对照组比较。在未处理的美洲大蠊肠道内，H2压力接近0（图1F）。在CYC处理后，中肠中心H2压力最大增加为51 kPa。然而，与CK相比，前肠（14.8-85.6倍）的增加率远大于中肠（6.8-8.4倍）和后肠（2.2-4.7倍）（图1F）。与未处理对照组相比，CYC处理的美洲大蠊中肠和后肠的pH值显著降低（图1G）。由于微传感器尖端难以定位到膨胀肠道中的测量点，因此在CYC处理的昆虫前肠中，pH值未成功测定（图1G）。当pH微传感器尖端穿透上部位点并移至pH测量内容所在的底部位置时，肠膨的肠道破裂。

图1. 新烟碱类物质处理后美洲大蠊的形态学变化及肠道H2压和pH值的变化。（A）经过CYC处理（右）和未处理对照（左）后的美洲大蠊第9龄若虫。(B）CYC处理（上）和未处理（下）美洲大蠊的解剖肠道。（C）LC20浓度下CYC处理后不同时间点体长的变化。（D）不同浓度CYC处理后36h体长的变化。在C和D中，不同字母表示在0.05水平上差异显著。（E）在LC20浓度下，CYC和IMI处理后36h的体长变化。*在0.05水平上差异显著。(F）CK和CYC处理间的H2压力比较。(G）CK和CYC处理的pH值比较。在F和G中，昆虫肠道中每个测试位点的横坐标对应于B中CK肠道的横坐标。由于pH微传感器尖端不能定位到膨胀的前肠中的测量点，因此CYC处理的昆虫（G）的前肠pH数据无法获得。在C-G中，数据是来自至少五次重复的平均值 ± 标准误。

2 新烟碱类物质对美洲大蠊甲烷排放的刺激作用

收集美洲大蠊肿胀前肠中的气体并用气相色谱法测定。在1.873min的保留时间处观察到一个单峰（图2A），这与甲烷标准品的保留时间几乎相同（图S3A）。然后对甲烷排放量进行测定和量化。LC20的CYC和IMI以时间依赖的方式刺激甲烷排放，CYC的排放速率在30 h达到峰值（37.3 ng/insect/h），IMI的排放速率在33 h达到峰值（23.3 ng/insect/h），分别是未处理对照的17.4和6.33倍（图2B）。在CYC和IMI中观察到甲烷排放的浓度依赖性刺激（图2C）。抗生素氯霉素（Cp）和 N-[2- （亚硝氧基）乙基]-3-吡啶甲酰胺（NPD）可基本消除杀虫剂处理对甲烷排放的刺激作用（图2D）。

图2. 新烟碱应用后美洲大蠊甲烷的鉴定和定量测定。（A）CYC处理后美洲大蠊肿胀前肠中甲烷的气相色谱鉴定。（B）在LC20和未处理对照组中应用CYC和IMI后不同时间点的美洲大蠊的甲烷排放。(C）不同浓度的CYC和IMI处理后36h美洲大蠊的甲烷排放量。（D）LC20浓度下CYC和IMI处理后抗生素对美洲大蠊甲烷排放的影响。为了计算甲烷的排放量，利用标准甲烷建立了色谱峰面积与甲烷量的关系线（图S3B）。在B、C和D中，数据是来自至少五次重复的平均值 ± 标准误。

3 新烟碱类物质对巢湖白蚁甲烷排放的刺激作用

在巢湖白蚁的无翼工蚁中，新烟碱类物质也刺激了甲烷排放（图3A），虽然没有观察到形态变化和肠道肿胀（图3B，图S4）。在LC20浓度下，CYC对甲烷排放的刺激作用大于IMI，这与美洲大蠊相似。在CYC处理的巢湖白蚁肠道中也测定了H2的压力。与美洲大蠊的结果相似，与未经处理的对照组相比，CYC处理的巢湖白蚁肠道中的H2压力显著增加（图3C）。然而，在后肠末端H2压力的增加可以忽略不计。

图3. 巢湖白蚁肠道H2压和甲烷释放量的测定。（A）在LC20浓度和未处理对照下，施用CYC和IMI后24h和36h的巢湖白蚁甲烷排放。(B）CYC处理组（上）和未处理组（下）巢湖白蚁的解剖肠道。(C）CK和CYC处理间肠道H2压比较。在C中，昆虫肠道各测试位点的横坐标对应于B中存在的肠道横坐标。在A和C中，数据是来自至少五次重复的平均值± 标准误。

4 新烟碱类物质对土壤和绵羊瘤胃液甲烷排放的影响

由于未能从美洲假大蠊培养产甲烷菌，我们无法确定美洲大蠊肠道产甲烷菌对新烟碱类物质处理有直接反应。相反，我们从中国湖羊的瘤胃液中收集产甲烷菌用于杀虫剂处理。对瘤胃液体进行CYC处理既不会改变气体排放总量（图4A），也不会增加甲烷排放量（图4B）。

新烟碱类物质可以在土壤中保持和累积，稻田是甲烷排放的主要人为来源。如果新烟碱类物质刺激稻田土壤产甲烷菌产生甲烷，可能会对环境造成影响。收集稻田土壤并用CYC和IMI处理。幸运的是，当使用环氧虫啶或吡虫啉直接处理产甲烷菌时，没有观察到含有产甲烷菌的稻田土壤中甲烷产生和排放的显著变化（图4C和D）。

图4.新烟碱类物质对中国湖羊和稻田土壤瘤胃液甲烷排放的影响。测定了不同浓度CYC处理的绵羊瘤胃液中总气体（A）和甲烷（B）的排放量。在CYC和IMI添加终浓度为500mg/kg的稻田土壤中，测定甲烷排放速率（C）和排放量（D）。数据是来自至少五次重复的平均值± 标准误。

5 美洲大蠊肠道细菌群落分析

采用16S rRNA测序方法对美洲大蠊前肠、中肠和后肠三部分细菌的多样性变化进行检测，并在CYC处理的个体和未处理的对照组之间进行比较（图S5）。在三个肠道部位，CYC处理引起了一些细菌属的显著变化（图5）。例如，前肠的Shimwellia从17.56%增加到45.93%（图5A），乳球菌（Lactococcus）从0.16%增加到10.68%，片球菌（Pediococcus）从0.81%增加到8.75%，中肠的Shimwellia从0.02%增加到7.03%（图5B），后肠的脱硫弧菌（Desulfovibrio）从5.90%增加到12.02%（图5C）。类似地，CYC处理后肠道中的一些细菌属也减少了，例如后肠道中的Arthromitus（g_Candidatus_Arthromitus）从34.04%减少到2.61%（图5C）。

图5. CYC处理与未处理对照美洲大蠊肠道三部分属水平细菌群落比较。通过LEfSe分析确定不同菌群间细菌丰度差异最大的类群，分类前小写字母表示分类等级，即g表示属、f表示科；如果分类中的分类术语被指定为“no-rank”，则显示更高的等级。在LEfSe分析中，使用第一个字母表示的分类等级。LDA评分阈值为4。（A）前肠(B）中肠(C）后肠。

6 美洲大蠊肠道古细菌和产甲烷菌群落分析

估计并比较CYC处理和未处理对照之间的古细菌和产甲烷菌群落（图S6）。尽管对来自处理组和对照组的中肠样本进行了一些试验，但我们无法获得足够的数据来估计这部分肠道中的古细菌和产甲烷菌群落。

与未经处理的对照相比，在美洲大蠊前肠中，CYC处理提高了古细菌群落中已鉴定的产甲烷菌的比例，主要体现在Methanocorpusculum的显著增加（图6A），其中，Methanobrevibacter、未分类甲烷杆菌科明显升高但并不显著，而未分类古细菌降低（图S6A）。前肠的产甲烷菌群落没有显著变化（图S6B），尽管甲烷杆菌纲和甲烷杆菌目有显著变化（图6B），但是，在CYC处理和未处理的对照组中，比例都可以忽略不计（图S6B）。

在后肠，产甲烷菌几乎占据了古细菌群落的100%（图S6C）。甲烷螺菌属和甲烷杆菌科（无属分类）两个分类群的相关丰度显著增加（图6C）。CYC处理后后肠中的产甲烷菌群落发生了各种变化（图S6D），其中Methanomassiliicoccaceae和Methanosarcinaceae显著增加，Methanomassiliicoccales显著减少（图6D）。

图6.CYC处理与未处理美洲大蠊前肠和后肠古细菌和甲烷菌群落的比较。用LEfSe分析确定了组间古生菌和产甲烷菌丰度差异最大的类群，类群名称前小写字母表示分类等级，即g表示属，f表示科，o表示目，c表示纲；如果分类术语在分类中被指定为“未分类”，则显示较高的等级。在LEfSe分析中使用第一个字母表示的分类等级。LDA评分阈值为4。（A）前肠中的古细菌，(B）前肠中的产甲烷菌，(C）后肠中的古细菌，(D）后肠中的产甲烷菌。

7新烟碱处理后昆虫肠道mcrA的定量分析

量化美洲大蠊肠道中mcrA的转录水平，并在新烟碱类物质处理和未处理的对照之间进行比较。mcrA转录水平在野生美洲大蠊肠道中保持稳定，但在杀虫剂处理中以时间依赖性方式增加并在36 h达到峰值（图7A）。在36 h时，CYC和IMI处理可使肠道mcrA转录水平分别比未处理对照增加8.01倍和3.97倍。杀虫剂处理引起的mcrA水平增加发生在后肠和前肠，而不是中肠（图7B）。CYC处理使后肠和前肠mcrA水平分别增加8.97倍和6.42倍，IMI处理的mcrA水平分别增加3.70倍和3.78倍。

图7. CYC和IMI处理后美洲大蠊肠道中mcrA丰度的测定。（A）杀虫剂处理后不同时间点美洲大蠊肠道中mcrA丰度的变化。(B）杀虫剂处理后36h肠道不同部位mcrA丰度的变化。数据是来自至少五次重复的平均值 ± 标准误。

讨论

杀虫剂在帮助我们防止害虫造成农作物损失的同时，也带来了多种环境问题。新烟碱类物质占全球杀虫剂市场的四分之一以上。然而，新烟碱类物质也被认为是蜂群崩溃障碍的主要因素。富含产甲烷菌的昆虫，如白蚁、蟑螂和金龟子，会释放出由肠道产甲烷菌产生的甲烷。昆虫排放的甲烷是大气甲烷的重要来源。以白蚁为代表，它们对全球甲烷排放的贡献约为3%。尽管这些昆虫不是新烟碱类物质的目标害虫，但由于新烟碱类物质在土壤中的积累、渗入水道以及植物中的系统持久性，它们经常暴露于新烟碱类物质中。暴露浓度的新烟碱类物质可能是亚致死的，但仍有可能对这些昆虫物种造成一些影响，正如它们对蜜蜂的亚致死影响。在这里，我们报告了一项发现，亚致死剂量的新烟碱类物质会刺激美洲大蠊，一种产甲烷菌丰富的昆虫的甲烷排放。在另一种产甲烷菌丰富的昆虫巢湖白蚁中也观察到了新烟碱类物质对甲烷释放的刺激作用。甲烷产生和排放的刺激不是对新烟碱类物质应用的一般产甲烷菌反应，因为新烟碱处理不会引起中国湖羊瘤胃液和富含产甲烷菌的稻田土壤中甲烷排放的任何变化。值得注意的是，高达500 mg/L的CYC降低了中国湖羊瘤胃液中甲烷的排放，可能是由于抑制了产甲烷菌的数量。结果表明，新烟碱类物质对瘤胃动物产甲烷菌无刺激作用。然而，新烟碱类物质是否能改变瘤胃内甲烷的生成，尚需进一步研究。这些结果表明通过间接方式刺激美洲大蠊肠道中的甲烷产生。

肠道中的甲烷生成通常是食物消化过程中的一个厌氧过程，其中许多微生物有助于产生甲烷。该过程与厌氧消化具有许多共同特征，厌氧消化广泛应用于处理有机废物和产生可再生能源，即气态甲烷。厌氧消化包括独特的连续水解、酸化、乙酸化、种间电子转移和产甲烷过程，每个阶段都涉及许多不同的微生物。在水解和酸化过程中，复杂的有机物转化为可溶性单体，然后转化为挥发性脂肪酸；随后，伴随着乙酸盐和氢气的形成发生产乙酸；甲烷生成是产生甲烷的最后阶段。对于厌氧消化中的这些过程，通过DNA序列鉴定相关微生物。虽然厌氧消化的微生物群落与肠道中的不同，但研究结果为我们的研究提供良好的参考价值。在我们的研究中，两种新烟碱类物质CYC和IMI在LC20浓度下直接或间接改变了美洲大蠊肠道中的细菌群落，一些增加的细菌属能产生更多的氢并改变肠道的pH值。Shimwellia是一种在CYC处理的美洲大蠊前肠和中肠中比例显著增加的属，属于肠杆菌科，产生典型的酸性发酵产物，如氢和乳酸。脱硫弧菌是一个在CYC处理后肠中比例显著增加的属，它可以与清除H2的产甲烷菌共养产生氢气，这些产甲烷菌能够形成共养条件，允许脱硫弧菌的细菌通过使用碳源生长。乳球菌是一个主要产生乳酸的属，在CYC处理的中肠中的比例有所增加，但在处理的前肠中比例较低。经CYC处理的中肠中，片球菌的百分比增加，可通过产生有机酸导致pH值降低。虽然乳球菌和片球菌属的细菌不产氢，但这些细菌的发酵产物为产甲烷菌提供碳源。就厌氧消化过程而言，乳酸菌和片球菌涉及水解和产酸；Shimwellia和脱硫弧菌作为产乙酸菌涉及产乙酸。到目前为止，关于这些不同的微生物群如何在厌氧消化中合作的信息很少。然而，我们的研究很好地证明了新烟碱类物质改变了细菌群落，导致更多的氢产生，从而刺激甲烷的排放。

通过对古细菌16SrRNA基因和产甲烷菌的mcrA进行测序，还确定了美洲大蠊肠道中产甲烷菌的群落变化。根据标准处理流程，产甲烷菌的分类群是通过不同的数据库进行鉴定的，这可能就是两种方法的主要分类群不同的原因。尽管如此，产甲烷菌的显著增加几乎是氢营养的。氢是产甲烷过程中的一个中心中间体，也是氢营养型产甲烷过程中最重要的电子供体。在CYC处理的美洲大蠊肠道中，产甲烷菌有两种途径来充分利用增加的氢，即改变产甲烷菌群落和提高产甲烷能力。在不积累氢的美洲大蠊的后肠中，产甲烷受到氢的严重限制。几个产甲烷菌属在CYC处理的美洲大蠊肠道（前肠和后肠）中的比例高于未经处理的对照，所有这些产甲烷菌属都属于氢营养型产甲烷菌，利用氢作为电子供体生成甲烷。产甲烷菌在系统发育上是多样的，但酶mcrA被认为是所有已知产甲烷菌的典型代表。在一些样本中，如处理污泥和废水样本的厌氧消化器中，mcrA基因可被认为是甲烷产量的生物标志物。在本研究中，CYC和IMI显著上调了美洲大蠊肠道（前肠和后肠）中的mcrA基因表达，这表明CYC处理的肠道中产甲烷菌群落比未处理对照具有更高的产甲烷能力。

通常认为产甲烷菌被限制在以氢为能源的扩大的后肠室中。肠道中积累的氢对昆虫是有毒的，来自非甲烷排放类群的昆虫会释放大量的氢，而来自甲烷排放类群的一些不能产生甲烷的个体通常会释放氢。大多数产甲烷菌尚未培养，只能通过分析其16SrRNA基因来推断其多样性。通过16SrRNA测序，在美洲大蠊的前肠和后肠中估计了不同的产甲烷菌，而不受后肠隔室的限制。美洲大蠊没有扩大的后肠隔室，其前肠的大小与后肠相当。这是这个肠道部分被表示为前肠，而不是像大多数产甲烷丰富的昆虫那样的嗉囊的主要原因。美洲大蠊的前肠和后肠的氢压相似，远低于中肠。美洲大蠊独特的肠道结构使得在前肠中含有产甲烷菌成为可能。前肠mcrA基因的成功检测和也为美洲大蠊前肠中存在产甲烷菌提供了间接证据。虽然暂时失败了，但我们确实尝试通过它们的factor420（F420）荧光来可视化美洲大蠊前肠中的氢营养产甲烷菌，以期获得直接证据。在未来，我们将继续寻找直接的证据来证实美洲大蠊前肠中产甲烷菌的存在。

在这项研究中一个有趣的发现，新烟碱类物质处理后美洲大蠊的前肠肿胀。在膨胀的前肠气体中检测到甲烷，这为我们测试使用杀虫剂后美洲大蠊的甲烷产生和排放提供了直接线索。前肠中甲烷的一个可能解释是前肠产甲烷菌使用前肠本身和中肠中的氢来大量产生甲烷。结果表明，新烟碱物质处理组的中肠和前肠的氢压显著高于未处理组。美洲大蠊的前肠气体不能从食道和中肠排出，从而导致前肠肿胀。美洲大蠊的后肠不积累氢气和甲烷，因此在它的后肠中没有观察到肿胀的现象。在美洲大蠊的后肠，甲烷是由产甲烷菌利用氢气产生的，并由肛门排出。

在昆虫肠道厌氧条件下，由于 NAD （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的循环利用困难和氧化还原反应的异常，积累的氢会抑制微生物对有机物的降解。因此，肠道中积累的氢对昆虫产生了不利影响，尽管这种影响可能是亚致死的，并且没有直接毒性，例如快速死亡。在产甲烷菌丰富的昆虫中，产甲烷菌能有效地利用所产生的氢，这是昆虫从肠道积累的氢解毒的重要机制。如果新烟碱类物质也能刺激肠道中不含产甲烷菌的昆虫（如蜜蜂）产氢，那么高浓度的氢是否可能导致对昆虫生理和种群增长的亚致死效应？

结论

总之，亚致死剂量的新烟碱类物质改变了美洲大蠊肠道中的细菌群落以产生更多的氢，然后刺激肠道产甲烷菌产生并排放更多的甲烷。类似的现象可以在白蚁中发现。这些发现对新烟碱类物质的应用提出了新的潜在环境风险。