上海地区养殖罗氏沼虾头部“白点病”的诊断

上海地区养殖罗氏沼虾头部“白点病”的诊断

项目资助：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（２０１９Ｍ０３）；中国水产科学研究院基本科研业务费（２０２０ＴＤ４１）。

王文雁等

罗氏沼虾（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ） 又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，是许多亚洲国家和地区重要的水产经济虾类。 在我国，罗氏沼虾最初由中国农业科学院引进试养，因其具有生长速度快、抗病力强、口感好、个头大、耐运输、国内外市场需求量大等优点，现已在各地广泛养殖。 上海位处长江口，具备优质的咸淡水资源，适合多种虾、蟹的繁殖和增养殖。 上海市奉贤区水产技术推广站于 １９８７ 年便开展了罗氏沼虾养殖试验并取得成功。 随后，金山区也开展了罗氏沼虾虾苗繁育技术研究，之后逐步发展壮大，现已是我国长三角地区罗氏沼虾亲虾及虾苗的重要供应基地之一。

近年来，病毒性疾病对水产养殖业发展的影响很大，已造成许多重大经济损失，对虾类健康养殖的威胁程度也日趋严重。 现已发现多种侵染罗氏沼虾的病毒，如双顺反子病毒、诺达病毒、虹彩病毒、黄头病毒、肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒等。 其中，虹彩病毒是一种胞浆型的双链 ＤＮＡ 病毒。 目前国际病毒分类委员会将虹彩病毒科细分为 ６ 个属：蛙病毒属（Ｒａｎａｖｉｒｕｓ）、淋巴囊肿病毒属（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｖｉｒｕｓ）、肿大细胞虹彩病毒属（Ｍｅｇａｌｏｃｙｔｉｖｉｒｕｓ）、绿虹彩病毒属（Ｃｈｌｏｒｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、虹彩病毒属（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ） 和十足目虹彩病毒属（Ｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）。 十足目虹彩病毒是近年发现的一个新属，感染罗氏沼虾的虹彩病毒（ＤＩＶ１）即为该属成员。

罗氏沼虾“白点病” 最初发现于我国广东珠三角养殖区，随后在福建漳州养殖区也有零星出现，近两年在江都、高邮、兴化等江苏的主养地呈暴发态势，危害严重。 近年来，在上海郊区养殖的罗氏沼虾也出现了头部“白点病”，造成大量沼虾死亡。 通过对上海地区患“白点病” 罗氏沼虾的组织病理及超微病理进行分析，并对其病原进行分子鉴定，确定该病为虹彩病毒（ＤＩＶ１）导致。 本研究首次在上海养殖区发现此病，应当引起养殖

户关注，加强防范，避免造成较大的经济损失。

１ 材料和方法

１．１ 样品来源及前处理

罗氏沼虾病虾样本采集于上海市奉贤区某水

产养殖场。 养殖池为大棚覆盖的淡水池塘，水温

为 １７～２０ ℃。 切取病虾的造血组织和健康虾的

造血组织，各分成 ３ 份：一部分放入预装有戴维森

氏 ＡＦＡ（Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ ＡＦＡ） 固定液的样品瓶中，常

温固定 ２４ ｈ；另一部分再细切成体积大小为 １ ～ ２

ｍｍ３的组织块后放入预装有 ２．５％戊二醛固定液

的离心管中，４ ℃固定 ２４ ｈ；剩余部分放入预装有

无水乙醇的离心管中，常温保存。 以上述 ３ 种方

式处理的组织分别用于组织病理、超微病理和分

子检测。

１．２ 普通组织病理检查

按 常 规 的 石 蜡 组 织 切 片 程 序 处 理 用

Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ ＡＦＡ 液固定的组织块。 组织块经脱

水、透明、包埋、切片、脱蜡、复水后，使用苏木精和

伊红（Ｈ＆Ｅ）对切片进行染色，Ｌｅｉｃａ ＤＭ４Ｂ 显微镜

成像及分析。

１．３ 超微组织病理检查

将 ２．５％戊二醛固定液固定的小组织块用０．１

Ｍ 磷酸盐（ＰＢＳ）缓冲液（ｐＨ ＝ ７．２）清洗，并在 １％

ＯｓＯ４（锇酸）中后固定 ２ ｈ，再次漂洗组织，并经梯

度乙醇逐级脱水。 脱水后，将样品包埋在环氧树

脂 ８１２ 中，６０ ℃聚合 ４８ ｈ。 用徕卡超薄切片机切

片，厚度为 ６０～７０ ｎｍ，铜网收片，乙酸双氧铀和柠

檬酸铅染色。 最后使用 ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ 透射

电子显微镜观察细胞病理变化。

１．４ 总 ＤＮＡ 提取

将乙醇固定的样品组织用超纯水漂洗 ３ 次，

去掉残留乙醇后，按照天根海洋动物组织基因组

ＤＮＡ 提取试剂盒的说明进行操作。 所有 ＤＮＡ 样

品用 ＴＥ 缓冲液洗脱，并于－２０ ℃保存备用。

１．５ 病毒基因检测

参考全国水产技术推广总站推荐的 ＰＣＲ 方

法———《虾虹彩病毒病诊断规程》 （ ＳＣ ／ Ｔ ７２３７—

２０２０）。 引物 ＤＩＶ１－Ｆ１（５’－ＧＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴ⁃

ＧＴＴＡＧＡＴ－ ３’） 和 ＤＩＶ１ － Ｒ１ （５’ － ＴＣＧＴＴＴＣＧＧ⁃

ＴＡＣＧＡＡＧＡＴＧＴＡ － ３ ’） 用 于 扩 增 虹 彩 病 毒

（ＤＩＶ１）的 ＡＴＰ 酶基因，由生工生物工程（上海）

股份有限公司合成。

ＰＣＲ 扩增 ２５ μＬ 体系： ＰｒｅｍｉｘＴａｑ 酶１２． ５

μＬ，正、反向引物各 １ μＬ，ＤＮＡ 模板 １ μＬ，灭菌双

蒸水 ９．５ μＬ。 ＰＣＲ 反应条件：９５ ℃ 初始变性 ３

ｍｉｎ；然后 ９５ ℃变性 ３０ ｓ、５９ ℃退火 ３０ ｓ 和 ７２ ℃

延伸 ３０ ｓ，共 ３５ 个循环；最后 ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎ。

ＰＣＲ 产物经 １．５％琼脂糖凝胶电泳后，于紫外光源

下观察分析。 取阳性 ＰＣＲ 产物 ５ μＬ 送测序，所

得核酸序列经修剪头尾的不可靠碱基后，输入美

国国家生物技术信息中心 （ ＮＣＢＩ） 数据库进行

ＢＬＡＳＴ 检索比对，确定病原序列是否与目标病原

一致。

２ 结果

２．１ 病虾的临床症状

在养殖过程中发现，罗氏沼虾突然停止进食，

很少在水面游动。 停饲后 ２ ～ １０ ｄ，死亡率可达

１００％。 尤其使用氯类制剂对发病塘进行水体消

毒后会导致沼虾死亡加剧。 病虾大多“偷死” 在

池塘的深水区，少数匍匐在池边浅水处，活力明显

减弱，反应迟缓，濒死个体失去游动能力。 病虾体

略微发红，空肠、空胃，体表明显症状是额剑基部

的造血组织颜色变白（见图 １），因此被养殖户称

为“白头病” 或“白点病”。 无论是单养罗氏沼虾

的池塘，还是与南美白对虾或日本沼虾混养的池

塘，均有“白点病” 发生。 此病具有传染性，呈现

区域性发病的特点，通常 １ 口塘发病后，周围几口

养殖塘甚至区域内其他养殖户的养殖塘也会陆续

发病。

图 １ 自然发病罗氏沼虾的头部白点症状 图 １ 自然发病罗氏沼虾的头部白点症状

２．２ 组织病理

组织病理检查显示，病虾造血组织出现了明显的病理变化：组织液增多和大量细胞坏死（ 见图 ２－ａ），部分区域呈现局灶性坏死（见图 ２－ｂ）。坏死细胞的细胞质中出现异常的嗜碱性包涵体，其细胞核呈现固缩现象（图 ２－ｃ ～ ｄ），细胞失去原有的结构特征。

图 ２ 患病罗氏沼虾造血组织的病理变化

ａ．被感染的造血组织含有大量坏死细胞；ｂ．造血组织的局灶性坏死；ｃ．造血细胞的变性和坏死，白色箭头示坏死细胞中的核固缩，黑色箭头示嗜碱性包涵体；ｄ．健康的造血组织，白色箭头示正常的细胞核。

２．３ 超微病理

超薄切片透射电镜结果显示，病虾的造血组织中出现大量虹彩病毒，部分区域的病毒颗粒聚集，呈晶格状排列，多数病毒颗粒呈分散状分布在组织细胞中。 造血细胞的细胞质中及细胞外基质中均可观察到病毒粒子，在细胞核中未发现病毒粒子。 成熟病毒粒子由正六边形的衣壳和近似圆形的核心两部分构成，衣壳电子密度较低，核心的电子密度较高。 病毒颗粒整体呈二十面体对称结构，直径为（１５３ ± ８） ｎｍ，其核心直径为（９１ ± ５）ｎｍ。 未成熟的病毒粒子仅有衣壳而无核心结构，呈空心状（见图 ３）。

图 ３ 患病罗氏沼虾造血组织的超微病理变化 图 ３ 患病罗氏沼虾造血组织的超微病理变化

ａ．大量虹彩病毒颗粒分布在造血组织中，Ｎ 表示细胞核；ｂ．∗表示造血细胞内的虹彩病毒复制和组装区域；ｃ．释放到细胞外基质中虹彩病

毒颗粒；ｄ．成熟的虹彩病毒颗粒具有近似正六边形的衣壳和电子致密的核心。

２．４ 分子检测

凝胶电泳结果显示，病虾样品均扩增出与阳性对照大小一致的目标片段（见图 ４），而健康沼虾无目的条带。 ＢＬＡＳＴ 检索结果表明，所有阳性片段测序获得的基因序列与虹彩病毒（ ＧｅｎｂａｎｋＮｏ．ＫＹ６８１０４０）序列一致性均达 ９９％以上，因此确定该病毒为十足目虹彩病毒 ＤＩＶ１。

图 ４ 患病罗氏沼虾虹彩病毒的 ＰＣＲ 检测 图 ４ 患病罗氏沼虾虹彩病毒的 ＰＣＲ 检测

注：Ｍ 表示 ＤＮＡ ｍａｋｅｒ，条带自上而下大小依次为 ２ ０００ ｂｐ、１ ０００ｂｐ、７５０ ｂｐ、５００ ｂｐ、２００ ｂｐ。 １ ～ ７ 为患病罗氏沼虾，阴性对照为健康罗氏沼虾，空白对照所用模板为水，阳性对照为黄海水产研究所提供的阳性核酸。

３ 讨论

３．１ 造血组织变白是现场诊断 ＤＩＶ１ 感染的重要依据

病原体突破宿主免疫防线，侵入特定组织或器官进行大量增殖，并严重破坏机体正常的细胞组织结构和功能，从而导致靶组织、器官或机体表现出明显的异常信号，这些临床上肉眼可见的症状信号是病因诊断的重要依据。 本研究通过电镜观察发现，ＤＩＶ１ 具有虹彩病毒典型的二十面体结构，其主要侵染罗氏沼虾造血细胞的细胞质，未发现 细胞核被感染的情况。ＤＩＶ１在细胞质中大量增殖，并形成了 较 为 透 明 的 病 毒 发 生 基 质， 即Ｈ＆Ｅ 组织病理切片中被异常染色的包涵体结构，这与 Ｑｉｕ 等观察到的病理结果相似。 此外，组织病理还发现，由于大量感染 ＤＩＶ１，因此病虾造血组织中出现大量的组织液及局部坏死病灶，这很可能是造血组织在临床症状上呈现不透明白色的原因。 而且，据现有的虾类疾病研究报道，此症状为 ＤＩＶ１ 感染罗氏沼虾所特有，其他病原感染尚未发现此现象。 因此，水产兽医或养殖户在塘口进行疾病诊断时，可利用这一特点进行初诊。

３．２ 虹彩病毒的流行及危害

ＤＩＶ１ 易感宿主范围广泛，主要集中在十足目的虾类，包括罗氏沼虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、脊尾白虾、日本沼虾、红螯螯虾和克氏原螯虾等。

有研究证实，三疣梭子蟹、中华绒螯蟹、粗腿厚纹蟹也是 ＤＩＶ１ 的易感宿主，但目前尚未有蟹类自然感染的报道。 流行病学调查显示，该病毒在我国主要虾类养殖地区均有检出，如广东、福建、浙江、江苏、安徽、上海、山东、河北、天津等，流行分布非常广泛。 因此给我国罗氏沼虾养殖生产的生物安保工作带来了巨大挑战。

甲壳动物对自身机体的免疫保护主要依靠血细胞来完成，血细胞随血液循环系统分布于全身各处，警戒着体外多种类型病原的入侵，如细菌、病毒、真菌、寄生虫等。 血细胞会根据入侵病原类型和数量的不同，采取不同的免疫防御策略，如细胞吞噬、细胞结节、包囊等。 由于血细胞不能分裂， 它 们 的 更 新 补 充 须 由 血 细 胞 的 生 产 工厂———造血组织来实现。 而 ＤＩＶ１ 首选靶组织是造血组织，当造血组织被病毒攻击后，机体免疫防御机能会被彻底破坏，易导致宿主快速死亡，因此ＤＩＶ１ 的危害性非常大。

３．３ 虹彩病毒的防控措施建议

罗氏沼虾“白点病” 暴发的原因及其病原传播方式尚不清楚，能否垂直传播尚无证据。 但根据本单位近几年的病原监测数据，ＤＩＶ１ 在苗期已有检出，因此养殖户在购买罗氏沼虾虾苗时，应严格筛选不携带 ＤＩＶ１ 的苗种进行养殖生产。 目前，为增加经济收益，混养模式已成为我国多数养殖地区的主流模式。 在疾病防控工作中需特别注意，当混养近缘性的甲壳动物，如南美白对虾、罗氏沼虾、青虾和克氏原螯虾等虾类时，因这些品种均为 ＤＩＶ１ 的易感宿主，在引进苗种前同样需加强对 ＤＩＶ１ 的检测，以降低病原传入的风险。 此外，罗氏沼虾与南美白对虾混养时，经常发现南美白对虾早于罗氏沼虾“偷死”。 因此，当南美白对虾出现病症时，应及早检测、确诊，以便及时采取相应的措施，减少损失。

水温与虹彩病毒病的暴发存在一定的相关性。 孙世玉等发现，当水温保持在 ３０ ℃ 以上，即使对虾携带有虹彩病毒也可正常生长，但转入低温环境则会引发疾病。 本案例中，罗氏沼虾“白点病”的发病季节是秋季，水温 １７ ～ ２０ ℃，处于高温转低温的阶段，与上述结论基本相符。 因此，养殖生产中需注意水温的变化，尤其是携带病毒且尚未发病的池塘，可采取加温保温的措施，以防止水温降低而导致疾病暴发。

罗氏沼虾“白点病” 发病速度快，传染性高，死亡率高，发病后很难挽救，因此重点在于预防。对有发病史的池塘应严格消毒清塘，防止二次感染。 养殖过程中应及时了解周围其他养殖户是否有发病情况，尽可能避免因引进外塘水源或其他交叉感染因素而导致疾病传播。 还可采取常用的预防病毒病措施———鱼虾生态混养，用凶猛性鱼类减少或消灭弱虾、病虾。 此外，采取加强池塘底部增氧、泼洒益生菌等措施，可以避免条件致病菌大量生长繁殖，调控水质，减少发病概率。 在降温期可通过增加水深、加强大棚保温、采取人工加温等措施来降低环境突变的影响。 一旦发现感染ＤＩＶ１，应及时做好发病池塘的管理，防止塘间传播，养殖废水不可任意排放，避免扩大传播区域。发病期间不宜使用刺激性大的消毒剂或纤毛虫类杀虫剂进行消杀，减少养殖虾的应激死亡。

请关注，点击我的头像进入个人主页可以查看我的更多作品，今日头条会对关注者推送我的更新。