【摘要】：丝瓜(Luffa cylindrical)是中国主要的瓜类蔬菜。实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于多个物种基因表达的绝对定量和相对定量研究中。目前关于丝瓜实时荧光定量PCR内参基因的研究还未见报道。本研究中克隆获得了一种丝瓜内参基因18S rRNA,并利用该内参基因为基础设计一对实时荧光定量PCR引物,解决了丝瓜实时荧光定量PCR检测中没有内参基因的现状,为研究丝瓜重要功能基因的表达模式和调控机制奠定基础。以丝瓜为材料,采用改进的CTAB法提取基因组DNA,根据GenBank公布的西瓜、甜瓜及西葫芦等18S rRNA基因设计一对引物扩增丝瓜18S rRNA基因全长。以丝瓜18S rRNA基因的核苷酸序列为基础,利用PrimerPremier 5.0软件,遵循实时荧光定量PCR内参引物设计的原则设计一对荧光定量特异引物,通过荧光定量PCR扩增曲线、融解曲线及引物特异性等验证引物。以丝瓜根、茎、叶、幼瓜(花后5 d)、商品瓜(花后12 d)、成熟瓜(花后30 d)、高温处理(38℃)叶片、低温处理(8℃)叶片、强光处理(2 000μmol·m~(-2)·s~(-1))叶片、弱光处理(200μmol·m~(-2)·s~(-1))叶片为材料,分析丝瓜18S rRNA基因在不同组织、不同生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下的表达稳定性。

首次克隆获得丝瓜18S rRNA基因,丝瓜18S rRNA基因全长1 862 bp,GenBank登录号为:KM656452。设计1条荧光定量PCR的内参引物:正向,GTGTTCTTCGGAATGACTGG,反向,ATCGTTTACGGCATGGACTA。利用该引物进行常规PCR扩增,获得1条271 bp特异条带,符合预期大小,经测序,为丝瓜18S rRNA基因的部分序列。利用该引物进行荧光定量PCR反应,结果显示3次重复的Tm温度分别为86.25、86.06和86.25℃,均只有1个特异峰,表明无引物二聚体,扩增条带单一,特异性强,没有非特异性扩增出现,表明设计的1对引物特异性强,扩增效率高,可用作丝瓜荧光定量PCR的内参引物实验。丝瓜18S rRNA基因表达稳定性分析结果显示,18S rRNA作为内参基因在10种情况下亮度基本一致,表明在丝瓜不同组织、各生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达,适合在丝瓜基因表达研究中作为内参基因。