Elon Musk说“It is amazingly hard to find a simple solution. A complicated one is relatively easy”，可见寻找复杂问题的简易解答并不容易。今天为大家分享一个来自北京大学吕华研究员课题组的最新进展，为实现聚二硫化物在蛋白质表面的原位生长提供了一个极简的解决方案(Cryopolymerization of 1,2-Dithiolanes for the Facile and Reversible Grafting-from Synthesis of Protein−Polydisulfide Conjugates)。作者通过冷冻提高了聚合反应平衡常数，利用冰晶生长过程中的溶质排出效应提高反应底物局部浓度，成功地以Grafting-from（GF）的方式可控制备了可无痕释放的蛋白质-聚二硫化物偶联物。制备蛋白质-高分子偶联物（PPCs）的方法主要有两种：一种是将预先合成的高分子与目标蛋白质（POI）进行偶联（GT），另一种是从POI原位聚合得到（GF）。其中GF的纯化步骤和合成路线更为简便，效率更高，是较为理想的一种合成方式。但目前可用于GF的聚合方法仍非常有限，主要包括可控自由基聚合如ATRP和RAFT。这些方法通常需要以化学或者基因工程手段在蛋白上引入合适的引发基团，且只能在蛋白上生长不可降解的高分子。因此亟需开发一种能够从天然蛋白质原位接枝可降解聚合物的简单有效方法。聚二硫化物是一类以动态二硫键为主链的聚合物，日内瓦大学Matile等人证明其是一类优异的胞内递送材料。新加坡国立大学Yao课题组以GT的方式实现了蛋白质与聚二硫化物的偶联，并用其高效地将蛋白质递送至细胞质。蛋白质半胱氨酸侧链的活性巯基常被选作小分子的修饰位点，理论上亦能用于引发环状单体如1,2-二硫戊环的开环聚合，以GF的方法构筑蛋白质-聚二硫化物（protein-PDS）偶联物，然而该构想一直未能实现。基于小分子巯基引发剂的实验表明该类单体如硫辛酸（M1）在水相及室温下的平衡单体浓度高达262 mM，然而若以插入了活性半胱氨酸的绿色荧光蛋白（Tev-Cys-EGFP）为引发剂，即使在300 mM单体溶液中都无法引发聚合；如此高的单体浓度也常常引发副反应导致蛋白质沉淀或失活，生物兼容性差。

图1 A) 蛋白质引发的1,2-二硫戊烷的冷冻聚合反应示意图; B) 25和-10 ℃下，TEV-Cys-EGFP和M1的反应混合物的荧光显微镜照片。为了实现蛋白原位引发聚合，作者选择了降低温度这一反直觉的策略，以较高的引发效率得到了聚合产物。该策略通过以下两点因素推动了反应平衡向聚合进行：1. 削弱因熵减而带来的热力学不利因素，从而提高聚合的平衡常数；2. 在冷冻系统中溶质被冰晶排出导致底物局部浓度升高（如图1）。通过对反应温度、时间、浓度和pH的筛选，作者发现该聚合反应在优化的条件下反应速度快（2h完成）、符合活性聚合的特征、引发效率高、分子量可控、分散度窄且具有较好的蛋白与单体的普适性和特异性（如图2）。

图2蛋白质介导的1,2-二硫化物冷冻聚合具有活性半胱氨酸依赖性接下来，作者展示了所制备的蛋白质-聚二硫化物偶联物的一系列有趣的特性，包括：还原条件下如GSH或DTT即可快速且“无痕”释放蛋白质，酶活实验验证了所释放蛋白质的功能不受显著影响。这种胞内释放能力结合聚二硫化物优异的细胞膜穿透能力，此类偶联物在蛋白质药物递送方面拥有的巨大潜力，作者随后通过两种模型蛋白GFP和DHFR的扫描荧光共聚焦实验对此进行了初步验证。总结而言，该文开发了一种简单通用的蛋白质原位引发开环聚合反应方法，实现了较高的聚合可控度与位点选择性，并可以无痕的方式释放功能蛋白，具有广泛的化学、生物与医学应用前景。北京大学化学与分子工程学院博士研究生鹿建华为论文第一作者，吕华研究员为通讯作者；此工作获得了国家重点研发计划合成生物学专项（2019YFA0904203）、国家自然科学优秀青年基金（21722401）、及博士后创新人才支持计划（BX20190004）资助。冷冻显微镜实验获得了中科院化学所王健君研究员及金晟琳博士的大力协助。全文链接：pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b12937