本发明属于中药材资源鉴定技术领域，具体涉及一种基于pcr-rflp技术鉴定广地龙的方法。

背景技术：

广地龙是钜蚓科动物参环毛蚓(pheretimaaspergillum)的干燥体，主产于广东广西，是中国传统的动物中药材，广地龙类制剂在临床应用广泛。广地龙有多种药理作用，主要有降压、平喘、解热抗炎、抗血栓、抗肿瘤等。地龙在中国民间有着几千年的用药历史，根据中国药典记载，地龙包括广地龙和沪地龙，其中广地龙的质量被认为行业品质最优。中国的蚯蚓品种较多，形态大小因品种差异而不同，加工成中药材后，增加了品种的辨别难度，不同品种其药效差异大。经调查，中药材市场上广地龙商品伪品较多，严重影响了中药材用药的稳定性和安全性，需要建立新的鉴定技术，准确地完成地龙商品的鉴定。

聚合酶链式反应限制性片段长度多态性分析方法(pcr-rflp)，是以pcr技术为基础，限制性内切酶对扩增产物序列有特异性识别，消化切割成不同大小片段，因扩增目的序列的限制性内切酶酶切图谱不同,从而产生不同长度的dna条带，以此用于中药材商品鉴定。pcr-rflp已广泛应用于中药材鉴定中，包括人参、淫羊藿、川贝母、何首乌等。中国药典记载，部分药材已采用pcr-rflp技术进行真伪鉴定。但有关利用pcr-rflp技术鉴定蚯蚓品种未见有报道。本发明利用pcr-rflp技术应用于中药市场的广地龙商品鉴定中，减少市场伪品的混入，为中药材质量提供保障。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单可靠的基于pcr-rflp技术鉴定广地龙的方法。

本发明的基于pcr-rflp技术鉴定广地龙的方法，包括以下步骤：提取待测蚯蚓样品的基因组dna作为模板，以coi基因的通用引物hco2198：5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’和lco1490：5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’作为引物进行pcr扩增，将pcr产物纯化后用限制性内切酶rsai进行酶切，对酶切产物进行电泳检测，若出现3个片段，则待测蚯蚓样品为广地龙。

优选，所述的pcr扩增的反应体系为25μl，包括dna模板1μl，10×pcrbuffer2.5μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/ldntps0.5μl，taqdnapolymerase1u，10μmol/l的hco2198与lco1490引物各0.5μl，余量为水；反应程序为：95℃预变4min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的酶切的酶切反应体系为20μl，包括纯化的pcr产物8μl，10×buffer2μl，0.1％bsa2μl，限制性内切酶rsai0.5μl，余量为水；反应条件为：37℃反应2h，加10×loadingbuffer2μl结束反应。

本发明利用coi基因通用引物进行pcr扩增，得到各蚯蚓品种的线粒体细胞色素氧化酶(coi)基因片段，并对其进行序列测序、对比，通过dnaman软件对不同品种蚯蚓coi片段全序列进行限制性内切酶酶切图谱分析，最终筛选到一种限制性核酸内切酶rsai对pcr产物进行酶切，用2％的琼脂糖凝胶(含eb)检测pcr产物的酶切结果，通过酶切图谱可以鉴别广地龙与其他品种。本发明操作简单可靠，可为广地龙商品的鉴定提供新的技术手段。

附图说明：

图1为pcr产物coi片段电泳图，从左到右，m：dl2000dnamarker、1：广地龙样品1、2：广地龙样品2、3：广地龙样品3、4：赤子爱胜蚓样品1、5：赤子爱胜蚓样品2、6：暗孔远盲蚓样品1、7：暗孔远盲蚓样品2、8：威廉环毛蚓样品1、9：威廉环毛蚓样品2、10：大腔蚓样品1、11：大腔蚓样品2、n：阴性对照。

图2为限制性内切酶rsai对不同蚯蚓品种coi片段的酶切位点分析图，限制性内切酶rsai识别碱基序列位点为gt/ac，其中广地龙coi片段有2个rsai酶识别位点，赤子爱胜蚓、暗孔远盲蚓及威廉环毛蚓coi片段均仅有1个rsai酶识别位点，大腔蚓coi片段则没有rsai酶识别位点。

图3为酶切产物电泳检测图，从左到右，m：dl2000dnamarker、1：广地龙样品1、2：广地龙样品2、3：广地龙样品3、4：赤子爱胜蚓样品1、5：赤子爱胜蚓样品2、6：暗孔远盲蚓样品1、7：暗孔远盲蚓样品2、8：威廉环毛蚓样品1、9：威廉环毛蚓样品2、10：大腔蚓样品1、11：大腔蚓样品2、n：阴性对照。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

1、dna的提取：

取不同品种蚯蚓(广地龙、赤子爱胜蚓(eiseniafoetida)、暗孔远盲蚓(amynthasobscuritoporus)、威廉环毛蚓(pheretimaguillelmi)及大腔蚓(metaphiremagna))组织30mg，用动物组织dna提取试剂盒(天根)进行dna提取，得到基因组dna作为模板。

2、coi片段扩增、纯化及测序：

以coi基因通用引物hco2198：5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’(如seqidno.1所示)和lco1490：5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’(如seqidno.2所示)进行pcr扩增，建立pcr反应体系，pcr反应在25μl体系中进行，包含dna模板1μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol/l)2μl，dntps(10mmol/l)0.5μl，taqdnapolymerase(2.5u/μl)0.4μl，hco2198与lco1490引物(10μmol/l)各0.5μl，加灭菌超纯水至25μl；反应程序为：95℃预变4min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；pcr产物使用pcr产物纯化试剂盒(天根)进行纯化，得到纯化的pcr产物(即coi片段)，序列测定由上海英潍捷基公司完成(图1)。广地龙coi片段的核苷酸序列如seqidno.3所示。

3、序列对比及酶切位点分析：

根据测序结果，利用dnaman软件，对不同品种蚯蚓进行coi片段序列比对及coi片段全序列限制性内切酶酶切图谱分析，根据酶切图谱的差异确定选择了限制性内切酶rsai进行酶切鉴定(图2)。

4、酶切反应：

酶切反应体系为20μl，包括纯化的pcr产物(即coi片段)8μl，10×buffer2μl，0.1％bsa2μl，10u/μl限制性内切酶rsai0.5μl，加灭菌超纯水至20μl，37℃反应2h，加10×loadingbuffer2μl结束反应。由此得到酶切产物。

5、酶切反应产物检测：

配制浓度为2％的琼脂糖凝胶，对酶切产物进行电泳检测；经限制性内切酶rsai酶切后，广地龙coi片段产生大小约为305bp、209bp、156bp3个片段，赤子爱胜蚓coi片段产生大小约为548bp、122bp2个片段；暗孔远盲蚓coi片段产生大小约为507bp、155bp2个片段；威廉环毛蚓coi片段产生大小约为515bp、143bp2个片段；大腔蚓coi片段没有限制性内切酶rsai识别位点，故条带仍约为659bp1个片段(图3)。

序列表

<110>广东省生物资源应用研究所

<120>一种基于pcr-rflp技术鉴定广地龙的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taaacttcagggtgaccaaaaaatca26

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggtcaacaaatcataaagatattgg25

<210>3

<211>670

<212>dna

<213>参环毛蚓(pheretimaaspergillum)

<400>3

tctaggatttgagccggataattggagccggaataagacttcttattcgtattgaattaa60

gacaacctggatccttccttggaagagatcagctatacaacacaattgtaacagcacacg120

catttctaataattttctttctagtaatgccagtatttattggtgggtttggaaactgac180

tgctcccacttatactaggaacccccgacatagcattcccacgtctaaataacataagat240

tttgacttttgccaccatccttaattctattagtaaggtctgcggctgttgaaaagggag300

ccggtaccggatggacagtttacccccctttagcaagaaacatagcacatgcgggcccct360

ctgtagaccttgcaattttctcactacatttagcgggtgcctcatcaattttaggtgcca420

ttaactttatcactacagtaattaacatgcgatgatcggggctacgcttagaacgaattc480

cactatttgtttgagccgtagtaattactgtagtacttctactattgtcgcttcccgtat540

tagccggtgctattactatattactaacagaccgaaatctaaatacatccttctttgacc600

ccgctggaggtggcgacccaattctatatcaacatctattctgattttttggtcacctgg660

gaaagtttaa670

技术特征：

技术总结

本发明公开了一种基于PCR‑RFLP技术鉴定广地龙的方法。本发明利用COI基因的通用引物进行PCR扩增，得到各蚯蚓品种的线粒体细胞色素氧化酶(COI)基因片段，并对其进行序列测序、对比，通过DNAMAN软件对不同品种蚯蚓COI片段全序列进行限制性内切酶酶切图谱分析，最终筛选到一种限制性核酸内切酶RsaI对PCR产物进行酶切，用2％的琼脂糖凝胶检测PCR产物的酶切结果，通过酶切图谱可以鉴别广地龙与其他品种。本发明操作简单可靠，可为广地龙商品的鉴定提供新的技术手段。

技术研发人员：黄庆;毛润乾;李志武

受保护的技术使用者：广东省生物资源应用研究所

技术研发日：2018.09.25

技术公布日：2019.02.01