养殖大菱鲆致病性鳗弧茵的生物学特性及免疫研究陈吉祥“，李筠1，朱开玲1，王祥红1，杜宗军1，2-#F庚2，李秋芬2266071)(1．中国海洋大学，山东青岛266000；2．中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛摘要从自然发病的大菱鲆(Seophthalmusm缸iIIl岫)体内分离的病原菌1101，经鉴定为鳗弧菌，回接感染实验表明对大菱鲆有较强的致病性，TL01对大菱鲆腹腔感染的半数致死量u)s0是2．32cfu／g；由鲈鱼分离的鳗弧菌w一1对大菱鲆腹腔感染的半数致死量LOso是3．04×103cug；血清学试验表明，W一1和1101都属于02血清型。用福尔马林灭活的鳗弧菌疫苗分别以浸泡、注射接种的方式对海水养殖大菱鲆鱼苗进行免疫，定期检测血清中特异性抗体，4周后用鳗弧菌悬液(3．7xlosefu／mL)O．2mL腹腔注射感染免疫鱼，结果表明灭活鳗弧菌疫苗用2种方式免疫后都能刺激大菱鲆产生特异性免疫反应，其中注射免疫组在l周后即可产生特异抗体，在6周内仍维持较高水平，最高达1228．8，免疫4周后人工感染后的免疫保护力为91．70％；浸泡免疫组在3周后才产生抗体凝集价，凝集抗体效价最高36，免疫保护力为33．30％。
关键词鳗弧菌；大菱鲆；免疫预防maximua)属于鲽形目鲆科，是近年来我国引进的一个优良海水养殖品种，经济价值高，在我国北方大菱鲆(Scophthalmua 沿海地区养殖较为普遍。但随着现代集约化高密度养殖规模的扩大，大菱鲆的病害问题日益严重，给养殖业造成巨大的经济 损失…1。现已报道的海水鱼类细菌病中弧菌病最为广泛流行并危害严重，几乎所有人工养殖的海水鱼类都受到过弧菌感染 的威胁，而鳗弧菌(Vibrioaaguinarum)是海水鱼类弧菌病中危害最大的病原菌，其病症为快速的爆发性败血症及组织损伤，病 鱼常常在2．3d内死亡，是鲆鲽类的主要常发病害，常给水产养殖业造成巨大的经济损失L2．3j。在鱼病治疗中使用抗生素及其他一些化学药物，会引起环境中包括致病性和非致病性微生物产生耐药性，药物残留及对 水环境的污染，因此用免疫法来预防鱼类的疾病是一条有效的途径，Duff于1942年首次将灭活的鲑鱼产气单胞菌口服免疫 应用于硬头鳟获得成功，国外已有许多关于鱼类疫苗研究的报道，而且已有相关产品出售，我国鱼用疫苗的研究起步较晚，尤 其海水鱼用疫苗的研究较少，近年来已见对鲈鱼、牙鲆等免疫法预防鱼病的研究报道H．5J。
本文报道从养殖大菱鲆病鱼分离 到病原鳗弧菌，进行了鳗弧菌的部分生物学性状及鳗弧菌灭活疫苗对大菱鲆鱼苗的免疫研究。1材料与方法1．1病原菌的分离发病的大菱鲆来自山东沿海的海水养殖场，对发病鱼用无菌生理盐水清洗两遍，无菌操作进行解剖，观察病理变化，用混 合取样法取腹水、肝、胃、肠、脾，肾、心脏等组织用匀浆器匀浆，无菌生理盐水进行10倍系列稀释，涂布2216E琼脂平板，28。C 培养24h，观察平板菌落，取优势菌，平板划线纯化菌种，进行菌种鉴定，并于一80。C冰箱保藏。1．2人工感染试验试验用大菱鲆及牙鲆用45cm×45em×25em泡沫箱饲养，采用盐度3％左右的自然海水，按正常饲喂、正常通气并换水， 随机分组，每组lO尾。将细菌接种于2216E琼脂斜面，28℃培养24h，用灭菌生理盐水震荡洗下，用稀释涂布平板法测定菌浓度。稀释成1护一基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(200lAA620207)*通讯作者E—mail：BErCEN@oue．edl|．∞ ·210·第一届海洋生物高技术论坛论文集 情况，半致死浓度的计算根据安德森的方法进行[6】。1．3菌种鉴定对病原菌采用传统的生理生化方法并结合分子生物学方法鉴定[7·8J。
1．4药物敏感实验 片(上海市伊华生化试剂公司)，28。C恒温培养36h，观察抑菌圈有无及直径大小。1．5试验鱼及饲养条件试验鱼来自山东莱州大华水产有限公司，其中浸泡免疫实验用鱼体长：4—7cza，体重4—99，注射免疫实验用鱼：体长8。 12era，体重10—209，于饲养池中正常饲喂配合饲料。正常供循环水并充气。试验期间水温为15．190C。1．6鳗弧茵灭活疫苗的制备鳗弧茵接种在2216E固体培养基上，280C培养24h，以灭菌生理盐水洗下，加入终浓度0．5％N甲N28cc灭活48h，即为注 (]09efu／mL)，以上疫苗低温保存备用，用时稀释10倍。1．7疫苗的无菌检验平板涂布：取0．1mL灭活疫苗在2216E平板上涂布，28。C培养48h后观察是否有菌落生长。1．8疫苗安全性检测 常饲养观察10d，观察鱼的活动及有无死亡。注射试验：每尾大菱鲆鱼苗进行腹腔注射灭活疫苗0．2mL，然后正常饲养观察10d，观察鱼的活动及有元死亡。1．9大菱鲆的免疫与采血 组50尾，经腹腔注射灭活疫苗O．2mL／尾，并以注射相同剂量生理盐水的鱼为对照组，数量相同。一周后，各试验组同法加强 免疫一次。
然后正常饲养，分别于首次免疫后的第1、2、3、4、5、6周各取5尾，进行尾静脉采血，分离血清，供测定凝集抗体效 价用。1．10抗体效价的测定采用96孔血凝板，用微量凝集反应测定抗体效价，抗原采用鳗弧菌注射用疫苗[9J。1．11攻毒感染试验 攻毒后饲养于泡沫箱中，每天换水2次，连续观察14d，统计死亡率，计算免疫保护力[免疫保护力=(1一受免鱼死亡率／x于照 死亡率)×100％]2结果2．1病原茵的形态及生理生化特征对分离的病原菌进行了形态学及生理生化鉴定，结果显示，从大菱鲆分离的1101其生物学性状与从鲈鱼分离的鳗弧菌 W一1基本相同。细菌在2216E琼脂平板28。C恒温培养29h。菌落圆形，边缘整齐，表面光滑湿润易挑取，略带白色，较透明， 略隆起，不泳动，直径1．0—2．Onnn，无色素产生，经染色观察发现菌体呈短杆状或弧状，单个分散排列，极生单鞭毛，革兰氏 染色阴性，氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵(0／F)阳性，对弧菌抑制剂O／129敏感(15唯g／rIlL)。·211· 第一届海洋生物高技术论坛论文集表1病原菌的形态特性及生理生化特征Tab．1andbiochemicalcharacte蒯c80fV．卸guill删Morphological ·212·第一届海洋生物高技术论坛论文集注：nl：极生单鞭毛；一：阴性；+：阳性；(+)：弱阳性；ND：未做试验；NF：未查到2．2病原茵与鳗弧茵标准菌株的血清学反应通过对制备的两株病原鳗弧菌血清与标准菌株的微量凝集反应试验结果表明，鳗弧菌w—l、TIDl与02血清型的鳗弧 菌标准菌株ⅥB2有较好的凝集反应，而与其它菌株没有反应，w—l和TIDI之间的反应也很强，说明二者属于同一个血清 型。
表2病原茵抗血清与鳗弧菌标准菌株的血清学反应Tab．2rescllorldanfisennnof withstandardSerologicalW—l。1101V．出lgIlillamInSerovarTL01V．ar垮mlanlmV．mlgui岫W—lV．出IgIlilhmmVIBlOl一一VIB202++vIB30B一一ⅥB404一一ⅥB505一一ⅥB606一一唧07 一一Ⅵ髓08 一一ⅥB909一一ⅧlO010一一W—l02++11D102++2．3病原茵的药物敏感性利用药敏纸片法测定了致病菌对23种抗菌药物的敏感性，病原菌TLOl对其中妥布霉素、呋喃妥因、庆大霉素、氟哌酸4 种敏感，对丁胺卡那、头孢唑啉、头孢呋新、氯霉素、四环素、羧苄青霉素、万古霉素等有耐药性，其它抗生素为中度敏感，w一1 对庆大霉素、红霉素、呋喃妥因、妥布霉素、复合磺胺药物敏感，结果见表2)。·213· 第一届海洋生物高技术论坛论文集表3鳗弧菌对抗菌药物的敏感性试验Tab．30fInhibitoryactivitycllemoIl蝴q期I【a吣toV．锄gll岫2．4病原鳗弧茵对大菱鲆的致病性对鳗弧菌病原菌TI_01以不同浓度腹腔注射感染大菱鲆鱼，结果表明从大菱鲆的病鱼分离的鳗弧菌T101和从鲈鱼分离 的病原菌w—l对大菱鲆都表现出较强的致病性，在人工腹腔感染后的3—4d内死亡，死亡鱼呈急性败血症的症状，内部症 状以消化道的肿胀、出血为特征，常见腹水，胃肠发红肿胀、有出血点，脾脏肿大，肝脏充血出血。
当感染剂量为loS,缸,g以上 半致死量为2．32×du／g，W—l对大菱鲆的半致死量为3．04×l护c击-u／g。表4病原鳗弧菌对大菱鲆人工感染结果Tab．4Ptesaxlts0fattifidalinfectionte对tsdturbot -214·第一震海洋生秘嵩技零论坛论文豢2。5凌菖裁务及安全性用甲醛灭活的疫荫经48h培养后，每组平板上均无菌落生长，可认为细菌已全部灭活。所有被浸泡和注射疫苗的大菱鲆 鱼全部存器，基进食及活动正常，莓议势疫蓥是安全幕薹毒戆。2．6免疫后大菱鲆抗体效价测定结暴大菱鲆经漫泡朔注射免痰瑶，坶产生了特异住的免疣发应，其抗体变化规律如表2和3所渌。浸淹免疫组程第3周开始 抗体升高，但抗体效价水平较低，个体羞异较大；眭射免疫组抗体产生较快，在l周后抗体即开始升高，个体之间的差异较小， 抗体效价求警蹇显稳定，免疫波答持续融闼较长，在6羼爨撬箨仍维持在较褰戆水平。表5浸泡免疫后大菱鲜血清抗体效价。oftheiIiRnel蠢orlmethodTab。5‰蜘秘岫fiterturbot张cei鼬泌byfiterAnt／body2week3week4week6week ．，， 囊涮翳_函磊磊—————弋忑赢了—————i忑磊r—————瓦磊忑■——～ControlControlControlContr01．鲤竺壁受骘受艘戬鲎l4
