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    • 合作单位：宁波大学

    运用欧易/鹿明生物技术：iTRAQ蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)

    研究背景

    拟穴青蟹（Scyla paramamosain）表现出高丰度，快速生长，高营养价值和强大的适应性，这使其对中国的野生渔业和水产养殖产生了巨大的影响。在过去的几十年中，中国的拟穴青蟹养殖发展迅速。但是，中国拟穴青蟹的单产低，无法满足不断增长的市场需求。母蟹的质量和养殖是人工育苗的基础。越冬是母蟹最常见的生物学特征之一，也是拟穴青蟹对不利自然条件的保护反应。许多因素会影响拟穴青蟹的越冬，例如温度，盐度，光照和pH。在水环境中，由于浮游生物，悬浮颗粒物和可溶性有机物的影响，入射光的吸收和反射很容易改变，这会影响水中的光强度，因此，光强度被认为是越冬期间的重要因素。

    先前关于光强度对动物影响的研究主要集中在肤色，行为，存活和生长，蜕皮和幼体变态，荷尔蒙分泌和应激反应，尚未研究光强度对拟穴青蟹的潜在分子机制。本研究采用iTRAQ蛋白组技术，比较了不同光强度下室内越冬后肝胰腺蛋白质组的定量变化。这项研究将有助于解释驱动在不同光强度下越冬的拟穴青蟹性状的潜在分子机制。

    研究思路

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    研究结果

    1、蛋白质组学数据的qRT-PCR验证

    使用qRT-PCR定量检测20种已鉴定DEPs（CNDP，ALT2，GCDH，IMPA2，CYC1，ASAA，FATP4，PIPSAC1，ADSS1A，RDH11，CFB，DB18，BODG，HCDH，APT，LvP5CDh，TPIB，GK，APRT和FABP）的mRNA转录水平以验证蛋白质组结果。针对10个随机选择基因的qRT-PCR结果所示，除TPIB，FATP4和RDH11外，大多数转录物表现出与iTRAQ结果相似的表达变化。总体而言，qRT-PCR与蛋白组学基本一致，证明了蛋白组学结果的可靠性。

    2、蛋白质组学鉴定结果

    使用iTRAQ标记定量蛋白质组学测定拟穴青蟹的肝胰腺样本，从45886个已知谱图中检测到21812个肽段，19983个unique肽段和3282个蛋白（图1a）。60.82％的蛋白被不少于三个肽所覆盖（图1b），表明鉴定蛋白具有良好的序列覆盖率。分子量10-20 kD（612），20-30 kD（586），30-40 kD（495），40-50 kD（430），50-60 kD（344）和60-70 kD（189）占总蛋白的80.93％（图1c）。此外，60％的蛋白表现出超过10％的序列覆盖率，而38％的蛋白表现出超过20％的序列覆盖率（图1d）。

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    图1 | iTRAQ标记定量蛋白质组学

    （a）iTRAQ蛋白质组学的基本统计数据；

    （b）不同unique肽段的蛋白分布；

    （c）不同分子量蛋白的分布；

    （d）蛋白的肽段覆盖统计；

    3、差异蛋白筛选鉴定

    用火山图比较显示了LL组，HL组和对照组的整体肝胰腺蛋白质组的差异，结果表明：与对照组相比，LL组（图2a）和HL组（图2b）的蛋白表达水平发生了显著变化。聚类分析显示，相似的样本在距离上相似，因此聚在一起（图3a和3b）。

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    图2 | 火山图显示拟穴青蟹肝胰腺样本中的DEPs

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    图3 | 拟穴青蟹肝胰腺样本中DEPs的聚类分析

    在LL组中，有267种蛋白发生了明显变化，其中122种上调（占45.69％）和145种下调（占54.31％）（图4a）。

    氨基酸转运和代谢途径中三种高度上调蛋白是凝血因子B（Q27081），甲硫氨酸腺苷转移酶2亚基β（Q566L8）和pyridoxal-dependent decarboxylase domain-containing protein 1（Q99K01）。三种高度下调的蛋白是二甲基甘氨酸脱氢酶（Q9DBT9），甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶1（Q5I597）和4-氨基酯氨基转移酶（P80147）。

    在碳水化合物转运和代谢途径中，仅UDP glucuronosyltransferase 2B18（O97951）显著上调；三个高度下调蛋白是dolichyl pyrophosphate Man9GlcNAc2 alpha-1, 3-glucosyltransferase (Q802T2), fumarylacetoacetase (A5PKH3)和 triosephosphate isomerase B (Q90XG0) 。

    在能量途径中，三种高度上调蛋白是NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 subunit C2 (Q02827), phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP] (Q16822)和malate dehydrogenase (Q5NVR2)；三种高度下调的蛋白是solute carrier family 25 member 35 (A3KPP4), aldehyde dehydrogenase (P11884)和V-type proton ATPase subunit S1 (O54715) 。

    在脂质转运和代谢途径中，三种高度上调蛋白是hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (Q16836), gamma-butyrobetaine dioxygenase (Q9QZU7)和alkylglycerol monooxygenase (A0JPQ8) ；三种高度下调蛋白是phytanoyl-CoA dioxygenase, peroxisomal (P57093), alpha-methylacyl-CoA racemase (O09174)和succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase (Q7TNE1) 。

    在核苷酸的运输和代谢途径中，只有adenine phosphoribosyltransferase (P54363) 被显著上调；5’-nucleotidase (Q05927)和dihydropyrimidinase (Q63150) 显著下调。

    在次生代谢途径中，细胞色素P450 3A41（Q9JMA7）和protein white （P10090）明显下调。

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    图4 | 不同光强度的拟穴青蟹肝胰腺样本中DEPs的分布

    在HL组中，299种蛋白发生了明显变化，其中252种蛋白（84.28％）显著上调，三种上调程度最高的蛋白是glutaryl-CoA dehydrogenase (Q2KHZ9), cytosolic non-specific dipeptidase (Q96KP4)和3-hydroxyanthranilate 3,4-dioxygenase (P46952)；下调最显著的两个蛋白是dimethylglycine dehydrogenase (Q9DBT9)和cystathionine gamma-lyase (Q8VCN5)。

    在碳水化合物代谢途径中，三种上调程度最高的蛋白是N-acetylglucosamine-6- phosphate deacetylase (Q6P0U0), phosphoacetylglucosamine mutase (F1RQM2)和 UDP-sugar transporter UST74c (Q95YI5)；只有alpha-amylase (P91778) 被显著下调。

    在能量代谢途径中，三种高度上调的蛋白是NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex subunit 6 (Q0MQA4), cytochrome c1, heme protein (Q9D0M3)和inorganic pyrophosphatase (O77460) ；V-type proton ATPase 16 kDa proteolipid subunit (P55277) 显著下调。

    在脂质转运和代谢途径中，三种上调程度最高蛋白是estradiol 17-beta-dehydrogenase 8 (P50171), diphosphomevalonate decarboxylase (Q62967)和acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic (Q9NR19) ；Phytanoyl-CoA dioxygenase (P57093) 显著下调。

    在核苷酸转运和代谢途径中，三种上调的蛋白是cytochrome P450 3A41 (Q9JMA7), cytochrome P450 3A24 (Q29496)和cytochrome P450 2L1 (Q27712) 。

    有趣的是，这两个比较组共有39个DEP（图4b），包括参与细胞代谢的Phytanoyl-CoA dioxygenase (P57093) 和 dimethylglycine dehydrogenase (Q9DBT9)。

    4.差异蛋白的功能富集分析结果

    关于BP，差异蛋白主要参与生物调节，细胞组分，细胞过程，代谢过程，发育过程，细胞定位，对刺激的反应和信号传递。关于CC，差异蛋白质主要与cell, cell part, extracellular region, extracellular region part, macromolecular and macromolecular complex, membrane, membrane part, membrane-enclosed lumen, organelle, and organelle part有关。关于MF，差异蛋白主要参与antioxidant activity, binding, enzyme regulator activity, catalytic activity, molecular transducer activity, transporter activity, and structural molecule activity（图5）。

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    图5 | 拟穴青蟹肝胰腺样本中DEP的GO富集分析

    与代谢相关的途径进一步细分为12个子集：xenobiotics biodegradation and metabolism (LL: 6; HL: 6)、核苷酸代谢(LL: 7; HL: 7)、metabolism of terpenoids and polyketides (LL: 4; HL: 2)、其他氨基酸代谢 (LL: 4; HL: 6)、辅因子和维生素代谢(LL: 10; HL: 10)、脂质代谢 (LL: 10; HL: 16)、糖类生物合成和代谢(LL: 8; HL: 6)、global and overview maps (LL: 10; HL: 11)、能量代谢(LL: 11; HL: 13)、碳水化合物代谢(LL: 11; HL: 17)、次级代谢的生物合成(LL: 13; HL: 2)和氨基酸代谢(LL: 13; HL: 12)（图6）。

    LL组DEP富集到164条KEGG通路（图6a），top 20表现出明显变化（图6c），其中7条pathway与代谢相关，如other types of O-glycan biosynthesis (ko00514), nicotinate and nicotinamide metabolism (ko00760), protein processing in endoplasmic reticulum (ko04141), geraniol degradation (ko00281), riboflavin metabolism (ko00740), pantothenate and CoA biosynthesis (ko00770), and regulation of lipolysis in adipocytes (ko04923) 。HL组DEP富集到205条KEGG途径（图6b）。top 20表现出明显变化（图6d），其中10条pathway与代谢相关，如glycosaminoglycan biosynthesis-keratin sulfate (ko00533), nucleotide excision repair (ko03420), linoleic acid metabolism (ko00591), folate biosynthesis (ko00790), mucin type O-Glycan biosynthesis (ko00512), lysine biosynthesis (ko00300), benzoate degradation (ko00362), nicotinate and nicotinamide metabolism (ko00760), ovarian steroidogenesis (ko04913), and arginine biosynthesis (ko00220)。

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    图6 | 拟穴青蟹肝胰腺样本中DEPs 的KEGG通路富集分析

    选择了与代谢相关的六个重要的2级重要子集，包括氨基酸转运和代谢，碳水化合物代谢，能量代谢，脂质代谢，核苷酸转运和代谢以及次级代谢产物的生物合成等，作为特异性代谢通路。

    实验结论

    采用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术研究在不同光强度下拟穴青蟹中蛋白表达变化。与细胞应激有关的蛋白PGD和RDH11在高光强度下显著上调，表明高光可能会诱导拟穴青蟹产生应激。由于有机体需要更多的能量来满足高光强度的要求，与能量产生相关的蛋白（包括GlcNAc-6-phosphate，PPase，ACSA，PGD和IMP）显著上调表达。与高光状态相比，低光状态更适合于拟穴青蟹的生存，并且在生理过程中起重要作用的蛋白质（如APT和BODG）被显著上调。由于这些过程消耗的能量较少，因此代谢过程中涉及的蛋白（如LvP5CDh，GK，TPIB和BH4）的表达显著下调。这些结果将有助于阐明控制水生动物能量代谢的调节机制，并使它们适应不同的光强度，也可能有助于从新的角度理解拟穴青蟹中不同光强度调节代谢的分子机制。

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    通过iTRAQ标记定量蛋白质组学在不同光强度下拟穴青蟹中蛋白表达变化，其中与能量产生相关的蛋白（包括GlcNAc-6-phosphate，PPase，ACSA，PGD和IMP）显著上调表达，代谢过程中涉及的蛋白（如LvP5CDh，GK，TPIB和BH4）的表达显著下调。这些结果将有助于阐明控制水生动物能量代谢的调节机制，并使它们适应不同的光强度。

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    参考文献：

    Li N, Zhou J, Wang H, Mu C, Wang C. The iTRAQ-based quantitative proteomics reveals metabolic changes in Scylla paramamosain under different light intensities during indoor overwintering. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Oct 1;207:111384. doi: 10.1016/j.ecoenv.2020.111384. Epub ahead of print. PMID: 33011457.

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