【摘要】：桑黄是一类大型药用真菌的统称,桑黄孔菌属(Sanghuangporus)目前共包括14个物种,其中,中国有9个物种,主要用于缓解妇科肿瘤症状如阴道出血、白带、腹痛、腹部肿块等。Sanghuangprous vaninii是桑黄孔菌属最常见的一个种。桑黄又称桑耳,中国最早的中药学著作《神农本草经》对其药用价值进行了记载。桑黄这一名称首次出现在唐朝甄权所著的《药性论》中。对其植物化学研究表明,桑黄的主要次级代谢产物主要为多糖、黄酮、萜类、吡咯烷酮等。现代药理学证明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物学活性。因此,桑黄有可能用于妇科肿瘤的治疗。然而,目前仍缺乏其对最常见的妇科肿瘤—宫颈癌的抗肿瘤活性及其作用机制的研究。目的:研究桑黄提取物对人宫颈癌Si Ha细胞的抗肿瘤作用及相关的分子作用机制,为桑黄的临床应用提供科学依据。方法:采用紫外分光光度法检测桑黄包括多糖、黄酮、酚类、三萜在内的主要活性成分含量。分别采用硫酸-蒽酮、福林-酚、亚硝酸-硝酸铝和香草醛-冰醋酸法对4种主要成分进行含量测定。选用人大细胞肺癌细胞(H460)、人宫颈癌细胞(Si Ha)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人肝癌细胞(BEL-7402)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为待检细胞株,采用CCK-8检测细胞活力。

应用透射电镜确定Si Ha细胞的超微结构变化。通过流式细胞仪测定细胞周期分布,细胞凋亡,线粒体膜电位,细胞内活性氧及钙离子。使用PI染料检测不同浓度桑黄提取物对Si Ha细胞周期分布的影响。使用Annexin V-FITC/PI检测定量检测桑黄提取物诱导的凋亡细胞的比例。使用JC-1探针检测桑黄提取物处理Si Ha细胞48小时后其线粒体膜电位的变化。使用DCFH-DA检测Si Ha细胞内活性氧水平的变化。使用Fluo-3 AM检测Si Ha细胞内钙离子水平的变化来评价桑黄提取物是否引起细胞内钙离子超载。Western blot分析用于探讨内质网应激和凋亡相关蛋白表达水平的变化。通过裸鼠皮下异种移植模型评估了其体内抗肿瘤作用。结果:桑黄抑制肿瘤细胞增殖的物质基础可能是以三萜、黄酮和酚类物质为主,桑黄提取物在体内和体外显著抑制Si Ha细胞的增殖。阻滞细胞周期并引起细胞凋亡导致了桑黄提取物诱导的细胞死亡。桑黄提取物可以将Si Ha细胞周期阻滞在G0/G1期,增加Si Ha细胞凋亡的比例,尤其是早期凋亡的比例。桑黄提取物诱导了内质网应激,其表现为GRP78和CHOP的表达升高,并伴有钙(Ca~(2+))的释放。Ca~(2+)过载和氧化应激促进线粒体膜电位的下降,并随后激活caspase-3和-9,最终导致细胞凋亡。结论:桑黄提取物在体内外对人宫颈癌细胞Si Ha细胞有显著地抑制作用。其作用机制可能与阻滞细胞周期并诱导细胞发生内质网应激-线粒体途径凋亡有关。