黄秋葵基因组DNA提取及鉴定

黄捷 1,2,陈晓斌 2,叶花兰 2,刘国道 1,2

（1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，儋州571737；2海南大学农学院，儋州571737）

摘要:黄秋葵细胞内含有丰富的果胶类多糖等次生物质,降低了从中提取总DNA的产量和质量。为了

获得高质量的基因组DNA,采用改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行提取,并对总DNA进行

了纯度和浓度的鉴定。结果表明,改良的CTAB法可有效去除次生物质对DNA的干扰,降低DNA的粘

稠度,样品DNA的质量和纯度较高,可用于随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增等分子标记分析。

关键词:黄秋葵;基因组DNA提取;RAPD

中图分类号:Q943 文献标识码:A

TheExtractionandIdentificationofGenomicDNAfromOkra

HuangJie1,2,ChenXiaobin2,YeHualan2,LiuGuodao1,2

(1TropicalCropGeneticResourcesInstitute,CATAS,Danzhou571737;

2ColegeofAgriculture,HainanUniversity,Danzhou571737)

Abstract:ThecontentofpecticpolysaccharidesandothersecondarymetabolitesishighincelofOkra,

whichinfluencesfrequentlytheyieldandqualityofgenomeDNAwhenbeingextracted.Inthisstudy,anew

methodofCTABwasintroducedwhichdobestforcharacterizationthepurityandconcentrationofgenome

DNA.Theresultshowedthatitcouldefectivelyeliminatetheafectionsofthesecondarymaterialsto

extractedgenomeDNAfromOkra,andwhichbesuitableforRAPDanalysisandothermolecularmaker.

Keywords:Okra,extractionofgenomeDNA,RAPD

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-70℃超低温冰箱中待用。

1.2试剂

CTAB、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、乙二胺四乙

酸（EDTA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、RNA酶 A

（RnaseA）、PrimerS125（上海生工合成）、2×TaqPCR

MasterMix（北京天根）、β-巯基乙醇、D2000（DNA

Marker）等。

1.3DNA提取

参照 DolyeJJ，DoyleJ等[6]的方法，对其进行改

进，具体步骤如下：

⑴称取0.5g左右的冰冻叶片置于研钵中，用液

氮迅速研磨成粉末状，分装到2个2ml离心管中，各

加入 800μl的 CTAB-free缓冲液 [7]（200mmol/L

Tris-HCl，50mmol/LEDTA-Na2，250mmol/LNaCl，1%

巯基乙醇）并迅速混匀，置于冰上10min；

⑵4℃，9000r/min离心5min，弃上清，加入800

μl65℃预热的3×CTAB提取缓冲液（3%CTAB，100

mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA-Na2，1.5mol/LNa-

Cl，1%巯基乙醇），充分混匀后置于65℃水浴中1h，每

隔10min轻摇一次，使样品充分悬浮在提取缓冲液

中；

⑶取出离心管，待冷却后加入等体积的氯仿/异

戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，4℃，13000r/min离心 5

min；

⑷取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻轻

颠倒混匀，4℃，13000r/min离心5min；

⑸取上清，加入等体积冰冷的异丙醇，轻轻颠倒

混匀，置于4℃沉淀30min；

⑹4℃，7000r/min离心5min，弃上清，用70%乙

醇洗涤沉淀2～3次，风干，加入300μl高盐TE缓冲

液（可65℃助溶），待沉淀溶解后，加入2μl10mg/L的

RnaseA，混匀，置于37℃水浴30～60min；

⑺加入200μl无菌水，混匀，再加入等体积的苯

酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻颠倒混匀，4℃，12

000r/min离心5min；

⑻取上清，加等体积氯仿/异戊醇（24：1）；轻轻颠

倒混匀，4℃，13000r/min离心5min；

⑼取上清，加2倍体积的-20℃的冰乙醇，轻轻颠

倒混匀，置于4℃沉淀30min，4℃，6000r/min离心5

min；

⑽70%乙醇洗涤沉淀2～3次，风干，加入100μl

低盐TE溶解，-20℃保存待用。

1.4DNA样品鉴定

1.4.1 DNA样品纯度及浓度的检测琼脂糖电泳检

测：用0.5×TBE电泳缓冲液配制的1%琼脂糖凝胶

（加GoldView染料）铺成4mm厚的胶，上样5μl，于

90V电压下电泳30min，于BioRAD凝胶成像系统上

观察电泳结果，拍照。

紫外吸收检测：将DNA样品取2μl，用无菌水稀

释50倍，在核酸蛋白分析仪上测定230、260、280nm

处的光吸收值及浓度，根据260与280nm的光吸收比

值及260与230nm的光吸收比值确定DNA的纯度。

1.4.2RAPD扩增反应以提取的 DNA为模板，10碱

基寡聚核苷酸为引物，在BiometraPCR仪上进行PCR

扩增。扩增反应体系：15μlPCR反应体积，ddH2O3.0

μl，2×TaqPCRMasterMix10μl，PrimerS1251.0μl，

DNAtemplate1.0μl。RAPD扩增条件为：94℃变性2

min，一个循环；94℃变性1min，36℃退火1min，72℃

延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，反应终止。

RAPD扩增产物检测条件：浓度为1.5%的琼脂糖

表112份黄秋葵种质

序号

种质编号（名称）

026-1（Pzsvo026）

019（Santacruz47）

B007-2

029

035

010（黄秋葵S-2）

021（Pzsvo021）

009（建宁洋辣）

016-1

003（黄秋葵）

013（黄秋葵）

WZS（黄葵）

拉丁文名

AbelmoschusesculentusL.

AbelmoschusesculentusL

AbelmoschusmoschatusMedicusMalv.

来源

海南

河北邯郸

上海

福建建宁

江西萍乡

台湾

江西萍乡

福建建宁

台湾

江西萍乡

上海闵行

海南五指山

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凝胶（加GoldView染料）；0.5×TBE的电泳缓冲液；上

样5μl，120V电压电泳1h。于BioRAD凝胶成像系统

上观察电泳结果，拍照。

2结果与分析

2.1DNA样品质量检测

利用改进的 CTAB法提取出来的 DNA呈乳白

色，风干后无色透明，经核酸蛋白分析仪检测后，所

得的结果显示：OD260/OD280的吸收比值在

1.63~1.90之间，说明得到的 DNA质量较纯。蛋白

质、酚类及果胶类多糖等次生物质去除比较干净，

RNA消去比较完全，提取时残留的氯仿、异戊醇、乙

醇等小分子成分能够基本除去。而OD260/OD230的

吸收比值在 1.99~10.3之间，也说明 DNA溶液中基

本上没有残存的小分子及盐类等杂质，DNA样品浓

度在 46.1μg/ml~332.9μg/ml之间，其纯度已达到下

游操作的要求，可用于ISSR等分子标记。

利用1%的琼脂糖凝胶对DNA样品进行检测结

果显示与分光光度计所得结果基本一致（图1）。跑出

的条带基本在同一水平上，迁移率低，条带清晰，大小

整齐一致，无拖带现象，表明DNA完整性好，RNA消

去比较完全；点样孔中没有出现荧光，说明提出的

DNA样品较纯，果胶类多糖等次生物质基本去除干

净，纯度基本达到下游试验的要求。由此可见，本试验

提取DNA所利用的经过改进的CTAB法适用于黄秋

葵等果胶类多糖含量比较高的植物材料。

2.2RAPD扩增检测

用该方法提取的基因组 DNA作为模板，以

Songon公司合成的S125（序列为：CCGAATTCCC）进

行 PCR扩增，扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，

BioRAD凝胶成像系统照相（图3）。可以看出，12份黄

秋葵种质的DNA经引物S125扩增后，出现清晰稳定

的条带，可以用于基于PCR扩增的分子生物学研究，

1 2 3 4 5 6 1 2 3

图1改良CTAB法提取的基因组DNA

1,2.029;3,4.035;5,6.010

图2常规CTAB法提取的基因组DNA

1.029;2.035;3.010

表2黄秋葵种质基因组DNA的浓度

样品编号

DNA浓度

（μg/ml）

OD260/OD280 OD260/OD230 OD230 OD260 OD280

026-1

019

B007-2

029

035

010

021

009

016-1

003

013

WZS

46.1

91.0

125.1

93.7

81.7

77.4

127.4

66.8

156.6

183.2

101.0

332.9

1.75

1.78

1.75

1.81

1.89

1.84

1.75

1.63

1.81

1.78

1.82

1.90

2.69

3.35

2.25

4.70

8.17

10.3

2.25

2.27

2.30

1.99

3.28

2.02

0.013

0.011

0.022

0.016

0.004

0.003

0.023

0.021

0.027

0.037

0.012

0.069

0.024

0.036

0.050

0.075

0.033

0.031

0.051

0.036

0.063

0.073

0.040

0.139

0.017

0.020

0.029

0.041

0.017

0.029

0.022

0.035

0.041

0.022

0.073

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图3随机引物S125扩增结果(RAPD)

1.026-1;2.019;3.B007-2;4.029;5.035;6.010;7.021;8.009;9.016-1;10.003;11.013;12.WZS

栽培种之间无明显的差别，而栽培种与近缘野生种之

间却存在着明显的差异。

3讨论

高质量的DNA是黄秋葵种质遗传多样性研究的

前提和基础，不同研究方法对DNA的质量要求不同。

植物基因组DNA的提取目前最常用的方法是CTAB

法和十二烷基磺酸钠（SDS）法，其原理是利用 CTAB

或者SDS破坏植物细胞膜，使细胞内含物释放出来。不

同的是CTAB通过与DNA结合形成复合物，有利于

DNA与变性蛋白及多糖等次生物质分开，而SDS是

与蛋白质和多糖结合成复合物，经离心后与DNA分

开。一般说来，植物体中最多的次生物质是蛋白质、酚

类及多糖，蛋白质一般不影响DNA的有效提取，通过

苯酚或者氯仿使其变性沉淀可以去除；酚类和多糖对

DNA的提取及下游操作影响较大。酚类物质经氧化后

易与DNA共价结合引起褐变，使DNA失活，为了有

效去除酚类，可以在提取缓冲液中加入一定量的β-

巯基乙醇和PVP，使酚类游离出来，防止酚氧化，或者

在磨样过程中加入少许PVP与酚类结合；多糖会与

DNA同时沉淀使DNA提取物呈胶状不易溶解，从而

影响对DNA样品的浓缩，而且干扰后续操作，如抑制

TaqDNA聚合酶的活性、影响紫外分光光度法对核酸

进行定量分析等。

黄秋葵细胞内含有丰富的果胶类多糖物质，属于

顽拗植物。在用常规的CTAB法提取过程中，通过氯

仿/异戊醇（24：1）抽提，高盐低温沉淀不能完全除去

果胶类多糖对黄秋葵DNA提取的影响，而且在用提

取缓冲液裂解细胞膜的过程中，果胶类多糖与样品形

成胶状混合物，不易使样品均匀悬浮在提取缓冲液中，

使得细胞膜裂解不充分而影响细胞内含物的释放。在

最后的离心沉淀中，得到的是DNA与果胶类多糖的

共沉淀，形成胶状物质，加入TE很难溶解。在用琼脂

糖凝胶进行电泳检测后可以看出点样孔有明显的荧

光，图谱有拖带现象（图2）。因此，我们对常规的

CTAB法进行了改良，在用提取缓冲液裂解细胞膜之

前，加入CTAB-free缓冲液[7]，充分混匀使果胶类多糖

溶解，经过离心后弃上清，可以将大部分的多糖除去，

然后再用CTAB提取缓冲液进行抽提。此外，还采取

了两步沉淀法，先用异丙醇沉淀，再用乙醇沉淀，这样

可以有效的将剩余的多糖去除，得到乳白色的DNA

沉淀（风干后变为无色透明），经电泳检测后可以看出

点样孔无明显的荧光，图谱也无明显的拖带现象（图

1）。此方法不但有效去除了果胶类多糖，而且还避免了

在抽提过程中由于用力过猛而使DNA降解的现象，

可以为黄秋葵等多糖含量高的植物的DNA提取提供

参考。

4结论

目前国内外在植物DNA提取过程中大多采用高

浓度的盐溶液去除多糖 [4,10,11]。本试验中采用传统的

CTAB法在提取缓冲液中加入氯化钠（NaCl）溶液以除

去多糖，所获得的DNA沉淀仍呈胶状，难以溶解于

TE溶液中，经琼脂糖检测后点样孔有明显的荧光（图

2）。鉴于此采取了裂解前去除多糖的方法，在用裂解液

裂解细胞膜前加入CTAB-free缓冲液，使果胶类多糖

溶解其中，再经过离心弃上清，除去大部分的多糖，最

后加入CTAB提取液裂解细胞膜，通过此方法获得了

高质量的DNA（表2，图1）。经RAPD扩增后可以看

出，扩增条带清晰（图2），满足下游操作的要求。此外，

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

2000bp

1000bp

750bp

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取样部位为幼苗时期的嫩叶，减少了次生物质的影响。

在提取过程中采用两步沉淀法，第一步先用异丙醇沉

淀，再用乙醇沉淀，不但有效地去除剩余的多糖，而且

避免了色素的沉积，使DNA沉淀呈乳白色。

参考文献

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