摘要：

鱼类属于低等脊椎动物,其性别决定机制包括基因型性别决定(GSD),环境依赖型性别决定(ESD)和基因-环境依赖型性别决定(GSD+ESD)。环境因素包括温度,光照,pH值,含氧量,种群密度,外源性类固醇类激素等,研究发现,温度是鱼类性别决定中影响作用较大且最关键的一类环境因素,被称为温度依赖型性别决定(TSD)。有些鱼类的性别决定受遗传和温度的双重控制,且具有性染色体,被称为遗传性别决定和温度依赖型性别决定的混合型(GSD+TSD),如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)就是一种GSD+TSD鱼类。尼罗罗非鱼雄鱼生长速度比雌鱼快30%多,发展高雄或全雄尼罗罗非鱼的养殖可有效提高经济效益。在尼罗罗非鱼性别分化关键期进行高温处理,可使雄鱼比例显著提高,即一部分遗传型雌鱼性逆转为生理型雄鱼。本研究以尼罗罗非鱼为研究对象,以正常养殖温度(28℃)和高温处理温度(36℃)进行养殖,通过分析各组生殖细胞类型和出现时序的差异,性别分化相关基因表达水平以及表达位置的差异,揭示高温处理的雌鱼与正常雌,雄鱼性腺发育过程的异同点。研究结果如下: 1,本研究通过HE染色和Vasa免疫组化对性腺组织进行分析,发现在21dpf,高温处理组与对照雌鱼组性腺发育形态相似,结果表明此时的性腺为卵巢样;在39dpf,观察到对照雌鱼组已经明显分化出卵原细胞,在对照雄鱼组性腺的外周分化出精原细胞,排列规则,而高温处理组的性腺未明显分化,且性腺中央出现了一个大大的空洞,但性腺细胞分化的趋势趋于对照雄鱼组,结果表明此时的性腺为精巢样的;99dpf,高温处理组与对照雄鱼组发育状况一致,分化出了精原细胞,初级精母细胞和少量精子,结果表明性腺已经转化为完全的精巢,但在高温处理组性腺周边区域出现大量的蜂巢状结构,可能影响性腺的功能。

这些结果表明,高温处理推迟了性腺内生殖细胞的分化,并且影响性腺结构发育的完整性,但最终性腺发育形成的生殖细胞类型与对照雄鱼组一致。 2,本试验研究通过免疫组化技术,检测了三组鱼性腺Cyp19a1a蛋白在不同发育阶段的表达水平和表达位置的差异。在21dpf,高温处理组性腺内Cyp19a1a的表达量和表达位置与对照雌鱼组相似,都定位在性腺的间质细胞,对照雄鱼组未表达;在39dpf,Cyp19a1a仅在对照雌鱼组中检测到,高温处理组和对照雄鱼组都未检测到,可定性的推测高温处理会导致Cyp19a1a蛋白表达显著下调,与对照雄鱼组趋于一致。在99dpf,三组鱼的性腺已经明显分化,性腺细胞类型能够明显的区分开,Cyp19a1a在对照雌鱼组性腺中的颗粒细胞和间质细胞中表达,高温处理组和对照雄鱼组结果一致,未表达Cyp19a1a。 3,通过免疫组化技术检测三组尼罗罗非鱼的雄性性别分化相关基因Dmrt1和Gsdf蛋白在不同阶段的表达情况。在21dpf,高温处理组,对照雌鱼组,对照雄鱼组Dmrt1和Gsdf蛋白表达没有明显的差异;在39dpf,对照雌鱼组几乎观察不到Dmrt1和Gsdf的表达,高温处理组和对照雄鱼组都高表达Dmrt1和Gsdf,表明高温处理组趋向于发育成雄性,结合此时期的Vasa免疫组化结果表明高温处理后发生性逆转的尼罗罗非鱼性别决定基因的表达差异要早于性腺细胞的分化。

在性腺发育到99dpf,能清楚的观察到高温处理组和对照雄鱼组的性腺细胞类型一致,明显的区分出精原细胞,精母细胞和精子,Dmrt1蛋白表达都定位在性腺的精原细胞和精母细胞,Gsdf蛋白表达定位主要在支持细胞中,结果进一步证明高温处理组的性腺已经转化为完全的精巢。 综上所述,在高温处理下,尼罗罗非鱼雌鱼经历了由雌到雄的性逆转,在这一过程中,一是性别分化相关基因表达模式发生变化,由与对照雌鱼表达模式相似,逐渐转变为与对照雄鱼相似;二是性腺中的细胞类型发生变化,也是由与对照雌鱼基本一致,逐渐转变为与对照雄鱼一致。但性腺中的细胞类型具体的转变过程还需要进一步研究。

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