【摘要】：近年来,脂肪肝作为一种疾病备受关注。脂肪肝主要特征是肝脏内脂肪堆积过多引起的病变,是一种常见的肝脏病理改变,严重会导致肝脏脂质代谢紊乱等疾病。研究发现,细胞内的脂滴(LDs)也被认为是自噬的底物。自噬作用动员来自LDs的脂质维持脂质的平衡,从而避免细胞内脂质超载。自噬功能紊乱与脂质代谢紊乱有关,例如脂肪肝和肥胖等疾病。芹菜素,也称为芹黄素,是天然存在的黄酮类化合物,存在于许多水果和蔬菜中,其中芹菜中含量最高。近年来,研究发现芹菜素具有降脂的功能活性,但具体机制并不清楚。因此,本论文研究了芹菜素对脂质积聚和细胞自噬两方面的影响,确定具体机制。本论文的主要研究内容及结果如下:(1)探讨芹菜素对棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质积聚的影响。利用MTT实验筛选出芹菜素的无毒作用剂量为0-160μM,棕榈酸的无毒作用剂量为0-250μM。利用细胞油红O染色观察细胞内脂质积聚情况,细胞内总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)试剂盒检测细胞内TC和TG含量,发现棕榈酸诱导后的HepG2细胞在添加芹菜素后脂质积聚显著降低,TC和TG含量下降。利用Western Blot法检测芹菜素对细胞AMP激活蛋白激酶(AMPK)通路蛋白表达的影响,发现芹菜素激活了棕榈酸抑制的HepG2细胞中的AMPK磷酸化,同时显著降低了脂质合成代谢关键蛋白固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)、固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)、经甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)和脂肪酸合酶(FAS)的表达。

(2)探讨芹菜素对棕榈酸抑制的细胞自噬的影响。利用细胞免疫荧光染色检测芹菜素对细胞内LC3表达水平的影响,细胞单丹黄酰戊二胺(MDC)染色检测芹菜素对细胞内自噬体形成情况的影响,发现棕榈酸组的荧光明显减少,芹菜素和棕榈酸共同作用组荧光明显增加。利用Western Blot法检测芹菜素对细胞雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路蛋白表达的影响,发现芹菜素可以抑制棕榈酸诱导的mTOR激活,同时显著降低了棕榈酸诱导的P62蛋白的表达,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达呈现相反的趋势。(3)探究芹菜素对棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质积聚与细胞自噬的关系。利用细胞内TC和TG试剂盒、油红O染色、细胞免疫荧光染色、细胞MDC染色、Western Blot法检测AMPK及P62、LC3蛋白的表达可以得到如下结果:经过AMPK抑制剂Compound C进行验证发现芹菜素确实能激活HepG2细胞的AMPK信号通路,同时Compound C可以消除芹菜素诱导的细胞自噬。经过自噬抑制剂CQ进行验证发现CQ可以消除芹菜素诱导的HepG2细胞自噬,同时CQ显著消除了芹菜素诱导的脂质积累下调,并导致在棕榈酸诱导的HepG2细胞中的脂质积聚增加。综上所述,芹菜素能够抑制棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质过度积聚,且是通过AMPK通路发挥作用的。芹菜素可能通过抑制mTOR的活性促进HepG2细胞自噬,从而减轻了棕榈酸诱导的脂质积聚。