生物技术在水产养殖中的应用 摘要：生物技术是现代生物学发展及其与相关学科交差融和的产物，包括基因工程技术、微生物工程技术、生化工程技术、细胞工程技术以及生物制品等领域。生物技术的全面发展给水产养殖学科的产生和发展提供了更为成熟的理论基础，不仅解释了水产养殖中一些理论基础，而且解决了很多水产养殖中困扰已久的难题。越来越多的自然科学技术被应用到水产动物遗传育种、水产动物营养与饲料、疾病诊断、免疫防控、水质调控以及水产品质量安全检测等方面。关键词：生物技术，水产养殖，应用 我国水产养殖有着悠久的历史，远在 3000多年前的殷末周初就有养鱼的记录，至公元前 5世纪的春秋战国时代，陶朱公范蠡根据当时的养鱼经验编写了世界上第一部养鱼著作《养鱼经》。经过几千年的养鱼实践，不断地积累了丰富的技术经验，水产养殖业取得了长足发展。到了近代，生物技术的全面发展，对水产养殖业产生了深远的影响，几乎对水产养殖的每个方面都起到了积极的指导作用。本文主要从水产动物遗传育种、水产动物营养与饲料、疾病诊断、免疫防控、水质调控以及水产品质量安全检测等几个方面简要论述生物技术的应用。 1生物技术在水产动物遗传育种上的应用 1.1分子标记技术水产养殖业的发展一直受到种质退化的严重制约，将分子标记技术应用于水产动物遗传育种的研究，不仅有利于防止种质退化、选育优良品种和对养殖品种的遗传改良，而且还有利于野生种质资源的恢复、保护，从而使水产动物健康养殖走上可持续发展的道路。
目前，一些常用的分子标记如同工酶、AFLP和微卫星等，已被广泛地应用到水产动物系统发育、遗传育种及疾病检测等领域的研究中。梁利群等 (2000)利用 RAPD技术对荷包红鲤抗寒品系的基因组DNA进行分析，找到了用 RAPD技术从分子生物学角度对荷包红鲤抗寒品系进行鉴定的方法[2]。 1.2人工雌核发育技术人工诱导雌核发育是指采用物理或者化学方法使精子遗传失活，再以这种精子激活卵子，但精子不参与合子核的形成，卵子仅靠雌核而发育成胚胎的技术。随着对鱼类天然雌核发育认识的不断深入，科学家也在不断探索人工雌核发育技术及将其应用于鱼类遗传育种中的可行性。目前，已成功培育出红鲤、斑马鱼 尼罗罗非鱼 、莫桑比克罗非鱼 、稀有鮈鲫等多个人工雌核发育品系，为研究鱼类性别决定机制、单性养殖及养殖新品种的开发研究和生产实践提供了宝贵素材。1.3人工多倍体诱导技术人工多倍体是运用染色体组操作技术使之在正常的二倍体基础上再增加一套或两套以上染色体的方法。因外加染色体是否同源而分为同源多倍体和异源多倍体。多倍体的诱导方法有物理方法、化学方法、远源杂交和倍间多倍体等。鱼类染色体的特点之一是可塑性较大，易于加倍，如果在精子入卵而第二极体尚未排出之时，对受精卵进行热休克 (高温)、冷休克 (低温)、高压或化学药品等处理，阻止第二极体排出卵外，则可诱导出三倍体个体。
如果抑制第一次有丝分裂，则可获得四倍体个体。四倍体鱼再与二倍体染交，也可获得三倍体鱼。种间杂交受精卵经三倍体诱导技术处理而培育出的三倍体称之为杂交三倍体。三部体鱼往往是不育的，这对经济鱼类的养殖意义重大，它避免了性腺发育阶段和产卵季节肉质下降及性腺发育时期的生长停滞和死亡率上升，减少了养殖成本，利用其不育性还可以控制养殖鱼类的迅速繁殖和防止对天然资源的干扰。人工诱导的主要目的在于利用三倍体具有生长快、肉质好、生命周期长等特点，另外三倍体种群还具有较高的抗病力和抗逆性。 1.4转基因技术在一定条件下，借助基因工程技术将外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体染色体上的过程称为转基因作用，所转移的基因即为转移基因，而含有转基因的鱼类称作转基因鱼 。1984年中国科学院水生生物所朱作言等将小鼠金属螯合蛋白基因与调控序列和人生长激素基因的DNA注射到鱼的受精卵核内，培育出生长速度快的转基因鱼，从而证明了外源基因可以在受体鱼内螯合、表达、促生长，并通过性腺传递给子代，建立了世界上首例转基因鱼模型。随后，美国、英国、加拿大等数十个实验室先后展开了鱼类基因转移的研究，并取得了一定成果。转基因鱼的研究成功展示了鱼类基因育种研究的广阔前景，并带来了多方面的潜在价值。
1.5细胞融合技术鱼类细胞融合技术指采用化学或物理的方法将两个或多个紧连的细胞融合成一个细胞。它改变了以往的传统鱼类育种方式，可按照人们的主观意愿，把来自不同组织类型的细胞融合在一起。鱼类细胞融合法在遗传育种、培育新品种等方面具有广阔的应用前景，正日益成为生物技术和细胞工程中的热点。易泳兰等把大鳞副泥鳅(♀)×鳗尾泥鳅(♂)杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵电融合，培育出了融合鱼，其外形兼有双亲特征。余来宁等采用电融合结合继代移核法，将对草鱼出血病病毒(FRV)有抗性的草鱼肝细胞株(GLA)的细胞核移植到草鱼未受精卵内，获得了一批不同发育期的胚胎和存活的仔鱼。 1.6细胞核质杂交(核移植)技术细胞核移植是应用显微操作，将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的方法。将一种动物细胞核移植到另一种动物卵细胞，由此发育成的杂种称核质杂种。细胞核移植的操作主要有供体和受体的准备、去卵膜、挑去卵核、分离囊胚细胞和移核等程序。严绍颐等将鲤鱼胚细胞核移植到鲫鱼去核卵中，获得的核质杂交鱼具有较高的养殖价值。谢忠明等以鲤鲫移核鱼二代为父本，黑龙江散鳞镜鲤为母本，经常规有性杂交获得第1代杂交种——颖鲤，已在全国推广。
1.7无特定病原(SPF)技术无特定病原动物是指无特定的病毒、微生物和／或寄生虫存在的动物。SPF指特定病原体的具体现状，不针对病原体的抗性或未来病原体的状况。SPF是一个病原控制概念，核心技术是病原检测技术。该技术在对虾中的应用很成功，推广普及较为成功，SPF对虾即为无任何特定病原感染的对虾，病原应符合3个标准：一是被可靠诊断的病原；二是可以被成功分离的病原；三是对产业可形成重要威胁的病原。SPF对虾的繁育工作遵循严格的病原监测和控制标准，采用一系列育种、养殖、成熟技术，完全将对虾的生命周期控制在人工条件之下，结合良种选育手段对种质进行改良。从实质上来说，这一过程是一种严格的接近理想状态的野生动物驯化过程，为对虾适应长期的人工养殖条件打下了基础 SPF对虾的主要贡献，一是能在人工控制条件下稳定保持一个或几个具有遗传多样性的无特定病原的对虾种群；二是能向对虾养殖企业提供 SPF亲虾和SPF苗种或高健康苗种。 2生物技术在水产动物营养与饲料中的应用 近年来，生物技术发展迅速，在动物营养研究和饲料业中得到了广泛的应用。利用生物技术生产的饲料添加剂，如酶制剂、微生物添加剂、寡糖、激素、短肽、核苷酸等，对促进养殖动物的生产性能，提高养殖动物的健康水平有重要作用；利用生物技术可开发饲料源，扩大蛋白质饲料来源，提高饲料的营养价值及利用率，促进养殖业的持续健康发展。
2.1基因工程技术随着基因工程技术的发展和运用，很多有生物活性的多肽或蛋白质可以较容易地被合成，且成本低廉。由于鱼类胃肠道对多肽和蛋白质的吸收能力较强，使得基因重组产品能较方便、快捷地对鱼类的生理活动进行调控，尤其是在促进鱼体生长方面。例如：对银大麻哈鱼、鲻鱼和草鱼投以基因重组生长激素，可有效刺激鱼体生长。 2.2酶工程技术酶工程是生物技术的一个重要组成部分，它是指在一定的生物反应器内，利用酶的催化作用，进行物质转化的技术。而酶制剂则是酶工程的代表性产物。酶制剂是从动、植物和微生物中提取制备的具有酶专一的高效生物活性物质，通常与少量载体混合而制成粉剂。目前，应用生物技术生产的酶有蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、植酸酶、纤维素酶、非淀粉多糖酶、果胶酶等。大多数酶来自真菌类。β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶等已经被克隆。水产动物饲料中添加适量合适的酶制剂，有利于促进养殖动物对饲料的吸收、转化，提高养殖动物的生产性能和健康水平。 2.3微生物工程技术微生物工程也称发酵工程，是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。该技术可用于饲料的青贮、改善饲料的营养价值、微生物饲料的生产以及用微生物来净化有毒的物质，消除有毒气体和恶臭物质以及处理有机废水、废渣等；还可用于生产抗生素、维生素、透明质酸、微生物蛋白、氨基酸和一些食品添加剂 (如柠檬酸、乳酸、天然色素等)等。
饲料中添加氨基酸可以平衡氨基酸的比例，提高蛋白质的利用效率，减少氮排出造成的环境污染。 3生物技术在水产动物疾病诊断中的应用 3.1核酸技术 3.1.1核酸探针核酸探针是指利用特定标记的DNA或RNA探针同病原生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交，以此来确定宿主是否携带病毒的一类分子生物学技术。该方法以其灵敏度高、特异性强、简便快速等特点，在病原检测中倍受青睐。如雷质文等采用原位杂交技术对中国对虾体内的自斑综合征病毒(WSSV)进行了检测，结果表明此技术在对虾暴发性流行病的诊断方面具有很高的应用价值。 3.1.2聚合酶链反应酶链反应技术(PCR)是指在引物的指导下，体外酶促反应，迅速扩增 DNA片段的一种方法。 PCR技术具有高度的灵敏性，但由于PCR受多种因素影响，需要进一步试验(如限制性酶切、探针杂交或核苷酸测序)加以验证。目前PCR在水产动物病原的操作中，已成功应用于毛蛤甲肝病毒、对虾桃拉病毒、白斑病毒的检测等。3.2免疫学技术 3.2.1单克隆抗体单克隆抗体是指由单个细胞传代所产生的高纯度、高特异性的抗体。它与常规血清抗体相比，具有更强的特异性与针对性，且制备简单，因而在病原检测中得以广泛应用。
20世纪 80年代后期，已成功研制出传染性胰腺坏死病毒、出血病毒等单克隆抗体，并用于鱼类多种疾病的诊断。近年来，有学者已成功制备了抗鳗弧菌的单抗和抗嗜水气单胞菌的单抗。我国在单克隆抗体技术中，将其应用于检测草鱼出血病毒和对虾白斑病毒，均获得了较为满意的效果。 3.2.2酶联免疫吸附 酶联免疫吸附检测 (ELISA)是将抗原或抗体吸附在载体表面，通过酶与底物显色来检测特异性抗原或抗体的技术。该技术具有反应迅速、特异性强、灵敏度高等特点。应用十分广泛，如樊景凤等应用间接ELISA法检测凡纳滨对虾红体病病原菌取得较好的效果。 3.2.3荧光抗体技术荧光抗体技术是根据抗原抗体具有高度特异性的反应，把荧光素作为抗原标记物，在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原复合物及其存在部位，在水产动物病原体的检测上得到了一定的应用。鄢庆枇等应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的弧菌。该技术的主要优点是特异性强、速度快、灵敏度高，但也存在缺点如非特异染色问题难以完全解决，操作程序较烦琐，需要特殊的昂贵仪器 (荧光显微镜)和染色标本不能长期保存等。 3.3生理生化反应细菌鉴定的基本原理是用数十个生理或生化特性去检测细菌，包括碳水化合物的代谢试验、蛋白质和氨基酸的代谢试验、碳源和氮源利用试验、各种酶类试验以及抑菌试验等。
传统的细菌鉴定方法手工操作较繁杂，鉴定细菌至少需要18～24h，在此基础上发展起来的细菌自动鉴定仪解决了这些问题，可在几小时内报告结果。ATB Expression自动细菌鉴定仪已在水产养殖中应用多年，但从另一方面来讲，目前使用的细菌自动鉴定仪是以医学上的常见菌为基础，因此对于一些在水产养殖中特有的病原菌，如何更好地使用鉴定仪进行测定，仍需进一步摸索、研究。 4生物技术在水产动物病害免疫防控方面的应用 4.1免疫增强剂免疫增强剂主要是通过活化自身的免疫机能而显示机体的防御效果，具有作用广泛、安全性高等特点。免疫增强剂的功能是多方面的，在鱼类中，可激活嗜中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用；激活淋巴细胞产生或分泌淋巴因子以协调体液免疫和细胞免疫；刺激抗体的产生和补体的生成等。 4.2疫苗技术疫苗是一类使动物体对特异性病原的感染产生免疫保护的制剂，已成为当今世界水生动物疫病防治的主流产品。国外早在上世纪40年代杀鲑气单胞菌菌苗就在鱼病防治方而开始应用， 1975年疖疮病疫苗在美国进入商品化生产。目前，挪威、美国、加拿大、荷兰等国鱼用疫苗产业化程度高、市场成熟，培育出众多从事鱼用疫苗开发的跨国公司，如 Alpharma、Aqua Health、 Intervet、Bayotek等。
我国水产疫苗研究起步较晚，始于20世纪60年代，珠江所是最早开始开展水产疫苗研究的科研机构，并于20世纪60年代末研制出我国第一个水产疫苗(草鱼病组织浆灭活疫苗)，之后研制出具有国际先进水平的“草鱼出血病活疫苗”。我国目前获得国家新兽药证书的水产疫苗产品仅有 3种，与先进发达国家有较大差距。珠江所以 “广州普麟生物制品有限公司 ”为载体运作的我国第一个水产疫苗基地于2007年12月通过农业部专家组GMP验收，标志着我国水产疫苗将走向产业化的一个重要里程碑。该疫苗基地建有细菌灭活疫苗、细菌亚单位疫苗、细胞弱毒疫苗、细胞灭活疫苗4条生产线，适用于目前我国水产疫苗产品的熟化与产业化。 5生物技术在水产养殖水质调控方面的应用 5.1生物过滤技术生物过滤是指任何采用活体生物去除水中杂质的废水处理技术，主要包括植物过滤、微生物过滤、动物过滤等。生物膜滤器因具有产生污泥少、运行管理方便、动力消耗少等特点，在水产养殖废水处理中得到了广泛应用，生物膜滤器存在生物膜熟化时间长，需要定期反冲洗，容易造成硝态氮积累等缺点；植物滤器结构简单，可以有效吸收养殖废水中溶解态的氮、磷污染物，并将其转化为经济产品，但是单独使用对养殖废水中有机物去除效率较低；滤食性动物可以有效去除养殖水体中的颗粒物质。
大型海藻过滤、生物膜过滤和动物过滤复合处理养殖循环水技术通过优势互补，达到水质净化和废物综合利用的目的，复合生物过滤技术正逐步成为研究的热点。 5.2微生物调控技术微生物作为物质的分解者和转化者，在自然界的物质循环中起着重要的、不可替代的作用。目前在污染物的降解、转化，资源的再生、利用，无公害产品的生产、开发及生态环境保护方面已得到了广泛应用，在水产养殖业方面的应用也有不少报道。目前在水产养殖中应用广泛的有益性微生物群种类繁多，包括有益细菌和真菌等。有益细菌从其功能分，大致可归为两大类：光合细菌和化能异养细菌。前者是一类能进行光合作用的原核生物的总称（目前应用的是红螺菌科的菌种）；后者包括：芽孢杆菌属菌种、硫杆菌属菌种、短杆菌属菌种、硝化菌属菌种以及亚硝化菌属菌种等，这些细菌是从自然界中筛选、纯化培养而来的。真菌类微生物研究较少，目前应用的有可以分解木质素和甲壳质的真菌、假丝酵母和酿酒酵母等，还有黑曲霉和米曲霉等放线菌。有益微生物群是水体物质循环的推动者，一些微生物可以作为指示物，来判断水体污染程度，同时还可以净化水体为水产动物提供饵料。 6生物技术在水产品质量安全检测中的应用 6.1微生物快速诊断检测技术主要还是利用水产动物疾病诊断中涉及到的生物技术来快速检测水产品中的有害微生物，例如 DNA探针技术，PCR技术等。
6.2药物残留检测技术我国水产品出口遭遇绿色贸易壁垒主要缘于“氯霉素事件”。这给我们的渔药残留监控领域提出了警示。检测技术日益趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化。酶联免疫法 (ELISA)，因其操作简便、灵敏度高、样品容量大、分析成本低，是渔药残留分析的理想方法之一。 6.3水环境污染监控技术生物技术在环境污染监控中的应用拓展了生物技术理论和应用范围。应用分子生物学技术研究污染物(重金属、多氯联苯、化学消毒剂等)对海洋生物基因表达调控的影响。对污染环境中的生物群进行分子监控，分析污染生物效应的机理，判断海水污染来源和污染程度，为有效地保护水环境，保护鱼类和人类免遭损害提供了有效的依据，以实施相应的保护措施。生物芯片技术在环境污染监测与评价中的应用研究是国家863计划于1999年底结合我国环境污染和环保微生物技术研究的具体状况迅速启动的8项环保微生物技术预研课题之一。 7结束语生物技术是20世纪末人类科技史中最令人瞩目的高新技术之一，同时也是2l世纪世界各国科学技术发展的重要内容。生物技术在水产养殖业中的应用，无疑对水产行业的发展产生着深远而深刻的划时代意义。但在我国生物技术还是一门年轻的学科，研究力度有待加强。
另外，目前我国的水产养殖业基本上还处于传统型，水产养殖从业人员，特别是基层工作者文化水平相对较低，科技普及推广遇到一定阻滞。如何加快水产养殖人才培养速度，有效引进生物技术或者其他交叉学科的新技术，推动水产养殖业的大发展，是水产养殖业亟待解决的问题。参考文献 [1]陈光荣,肖克宇,翁波,等.鱼类细胞工程遗传育种研究进展[J].水利渔业,2004,24(1):4～6． [2]陈舒宁.保障水产品质量安垒疾病防控是关键——中国水产科学研究院珠江水产研究所所长吴淑勤研究员专访[J].广东饲料,2008,17(5):9～12． [3]丁理法,叶婧.生物技术在水产动物营养与饲料研究中的应用[J].水产科技情报,2008,35 (5):229～232． [4]樊景凤,梁玉波.凡纳滨对虾红体病病原菌间接 ELISA快速检测方法的研究[J].水产学报，2006,30(1):114～l17． [5]冯定远,于旭华.生物技术在动物营养和饲料工业中的应用[J].饲料工业,2001,22(10): 1～7． [6]管敏强.生物技术在动物营养中的应用[J].兽药与饲料添加剂,2001, (6):32～33． [7]贾方钧,王剑伟,吴清江.异源精子诱导稀有的人工雌核发育[J].水生生物学报,2002,26(3)：246～252． [8]金丽.鱼类的人工繁殖技术[J].生物学教学,2005,30(4):2～4． [9]康波,杨焕民,姜冬梅.生物技术在动物营养中的应用[J].现代畜牧兽医,2005,(1):40～43． [10]雷质文,史成银.PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测白斑综合征病毒(wssv)[J].青岛海洋大学学报,2001,31(2):201～204． [11]李卢.人工雌核发育在鱼类遗传育种中的应用[J].水产科技情报,2006,33(2):56～58． [12]梁利群,孙效文.用RAPD技术鉴定荷包红鲤抗寒品系[J].水产学杂志,2000,13(1):15～20． [13]刘晓慧,王义权.分子标记技术在水产动物研究中的应用[J].厦门大学学报,2008,47(2):228～231. [14]柳淑芳,李晓川.生物技术在水产品质量安全检测中的应用与展望[J].农业质量标准,2006,(5):47～49．[15]亓晓艳.分子生物学技术在水产动物疾病诊断和预防中的应用[J].吉林畜牧兽医,2008,29 (9):13～15． [16]宋钢,蒋吉生,田春.生物技术在水产病害防治中的应用[J].北京水产,2004,(4):42～44． [17]宋晓玲,黄倢.无特定病原(SPF)对虾种群的选育及应用[J].渔业现代化,2006, (6):17～20． [18]魏海峰,代智能,刘长发,等.复合生物过滤技术在水产养殖废水处理中的应用研究进展 [J].渔业现代化,2008,35(1):28～31． [19]魏祥东,陈东江,叶长明,等.有益微生物群在水产养殖中的应用及发展前景[J].中山大学学报,2002,(41):128～131． [20]温茹淑,崔淼.转基因鱼的研究进展[J].嘉应大学学报,2002(6):40～45． [21]谢忠明.“八五”国家重点推广养殖对象:颖鲤[J].淡水渔业,1992,(2):48． [22]鄢庆枇,邹文政.应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌[J].海洋科学,2006,30(4):16～19． [23]严绍颐.鱼类细胞核转植(基因组转移)和育种[A].海洋生物技术研讨会论文集[C],1991，79～83． [24]易泳兰.鱼类囊胚细胞和卵的电融合[J].水生生物学报,1988,12(2):189～192． [25]余来宁.用电融合结合继代移核方法构建草鱼抗病体细胞工程鱼[J].水产学报,1996,20 (4):314～318． [26]张七璀.海洋生物技术新进展[M].北京:海洋出版社.1999.140～147.[27]赵浩斌,陈尚萍,朱作言.转基因鱼的研究进展[J].农业生物技术学报,1999(3):30l～306． [28]邹为民,陈信廉.细菌自动鉴定仪在水产动物疾病诊断中的应用研究[J].珠江水产,2000, (4):9～11．
