基金项目:国家863计划青年基金项目(2001AA628130)

作者简介:郭华荣(1970-),女,山东荣成人,副教授,博士,主

要从事鱼类细胞培养和分子生物学研究,E-mail:huarong-

guo@ouc.edu.cn

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MarineSciences/Vol.31,No.10/2007

团培养法。具体方法是在培养基中添加较高浓度的

Ca

2+

和Mg

2+

,则悬浮培养的海绵细胞在几小时内就

会开始自发聚集,在几天内形成直径1~3mm左右

的小团,称为primmorph。primmorph是一个高度有

组织的结构,其外面覆盖一层单层扁平上皮细胞,内

部由球形细胞构成。端粒酶活性测定表明,海绵的所

有体细胞都具有端粒酶活性,但分散的海绵单细胞

培养物却检测不到端粒酶活性;不过,当其形成细胞

团以后,又可以检测到端粒酶活性。端粒酶活性的有

无与细胞的寿命和永生性密切相关,目前对于海绵

中端粒酶的这种调控表达机制还知之甚少。近年来,

细胞团培养法已成为一种有效的海绵细胞体外培养

方法,其优点在于,海绵细胞团的制备比较简单,而且

制备过程中,增加了对污染的真菌和非共生细菌的

清除几率。

2腔肠动物门(Cnidaria)

腔肠动物门包括珊瑚、海葵和水螅等,是真正的

二胚层多细胞后生动物,有了组织的分化,但结构简

单,体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结

构的中胶层( mesoglea) 构成, 细胞类型少。许多腔肠

动物内共生有虫黄藻和绿藻等单细胞藻类。有许多

研究者进行了腔肠动物组织细胞的分离和培养, 但

只有Fr ank 等

[ 8]

成功地得到了10 种腔肠动物的长期

培养物, 细胞于体外培养 7~ 20 d 后开始增殖, 仅能

传代几次, 最长存活时间达 1 a 左右, 并被冻存。但

细胞复苏后, 被真核单细胞生物( 网粘菌门) 所污染,

这些微生物在培养基中优势生长, 导致细胞培养失

败。

随后的大量研究主要集中在腔肠动物的细胞分

离技术和培养基质两个方面。研究表明, 细胞分散技

术对存活细胞的数量、组织培养的好坏和培养时间

的长短都有很大影响。在体外培养基质的研究中发

现, 体外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培

养基质有着很严格的要求。在培养时, 多数腔肠动物

细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活

[ 9]

, 而

且它们只有附着于由中胶层残片( mesoglea pieces)

构成的基质上, 才能很好地贴壁、铺展和迁移

[ 10]

。因

此, 寻找和制备可以替代腔肠动物中胶层的培养基

质, 是保证今后腔肠动物细胞体外培养工作成功开

展所必须解决的关键技术问题之一。

3 环节动物门( Annelida)

环节动物分为3 个纲: 多毛纲( 沙蚕) 、寡毛纲( 蚯

蚓) 和蛭纲( 水蛭) , 其中只有沙蚕属海产。环节动物

身体出现分节, 具真体腔, 是比较高等的无脊椎动物。

目前尚未见有沙蚕细胞培养的成功报道。水蛭的神

经细胞培养也还停留在原代培养阶段。由于蚯蚓在

无脊椎动物免疫学、环境污染和进化上的重要意义,

蚯蚓的细胞培养引起了人们的关注, 但是早期的许多

尝试并不是很成功。近年来, 只有 Battaglia 和

Davoli

[ 11]

报道了对蚯蚓体外培养条件的研究结果, 成

功得到了可以在体外存活 1 a 以上的蚯蚓细胞培养

物, 该培养物中含有 3 种不同类型的细胞, 但是没有

观察到细胞增殖的现象。其中一种悬浮生长的直径

在 20 Lm 左右的培养细胞, 在形态学上与蚯蚓的体

腔细胞很相似。总的来说, 环节动物的细胞培养工作

多年来几乎没有什么进展。

4 节肢动物门( Crustacea)

节肢动物是动物界中数量最多的一类无脊椎动

物, 以昆虫的数量最多, 占节肢动物的 94%。其中,

属海产的种类有甲壳纲动物如虾类。人工养殖虾类

病毒检测和疫苗制备的需要, 推动了虾类细胞培养工

作的开展, 并成为近年来海洋无脊椎动物细胞培养的

研究热点。自 1971 年 Peponnet 和 Quiot

[ 12]

首次报

道螯虾和美洲龙虾的类淋巴组织的培养以来, 已开展

了大量的虾类细胞培养工作。目前, 虾类的原代细胞

培养已经成功, 并且在虾类病毒的检测和疫苗制备中

得到了成功的应用

[ 13~ 15]

。其中, 我国学者童裳亮在

中国明对虾的原代细胞培养上取得了可喜的研究成

果, 开发出了适合对虾生长的对虾专用培养基MPS,

所培养的淋巴组织和心脏组织在 3 d 后就能形成连

续的细胞单层

[ 14]

。

虽然虾类的细胞培养目前仍停留在原代和传代

培养阶段上, 还没有一个永生性细胞系建立起来, 但

是在培养方法和技术上已积累了许多经验。研究表

明, 海产虾类培养基的渗透压范围一般在 720~ 760

mOsmol/ L 之间; pH 值范围一般为 7. 0 ~ 7. 5; 适宜

温度为 25~ 28 e ; 所用培养基最好使用虾的专用培

养基( MPS) , 并添加15% ~ 20%的胎牛血清, 有时也

可添加 20%的虾肌提取液或淋巴液等; 比较容易培

养的组织主要为心脏、卵巢和血淋巴等。

在以建立永生性细胞系为目标的虾类细胞培养

中, Fr aser 和Hall

[ 16]

对斑节对虾卵巢组织和 Ow ens

和 Smith

[ 17]

对斑节对虾心脏组织的细胞培养取得了

很大进展。Fraser 和Hall 体外培养的卵巢组织细胞

由形态不同的 4 种细胞组成: 上皮样细胞、成纤维样

细胞、圆形细胞和含大细胞核的上皮样细胞。其中,

上皮样细胞在 Gr ace 培养基中生长最快, 但是存活时

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海洋科学/ 2007 年/ 第31 卷/ 第10 期

间短, 不到2 个月; 而成纤维样细胞在2 @ L-15 培养

基中形成了连续性细胞单层, 成功传代3 次, 共存活

了17 个月, 并且在培养到3 个月和9 个月的时候, 部

分培养瓶中的成纤维样细胞转变为有大型细胞核的

上皮样细胞, 这些上皮样细胞聚集在一起, 但是不能

传代培养。而Ow ens 和Smith 体外培养的心脏组织

细胞在体外存活了10 个月, 细胞的分裂能力在体外

维持了40 d。

今后, 要实现建立虾类永生性细胞系的研究目

标, 首先需要突破的是虾类细胞系的永生性转化问

题

[ 18]

。近年来, 哺乳动物细胞永生性转化技术的不

断进展, 包括端粒酶研究和永生性相关基因及其转

染研究, 给这一目标的实现带来了希望

[ 19, 20]

。

5 软体动物门( Mollusca)

软体动物的数量仅次于节肢动物, 为动物界中

第二大类群, 包括各种螺类、双壳类、乌贼和章鱼等。

软体动物是细胞培养研究开展得最多的一类海洋无

脊椎动物, 主要源于以下5 个方面的研究需要: ( 1)

病毒性疾病的诊断和治疗; ( 2) 软体动物的巨大神经

元, 是研究神经生物学的难得的实验材料; ( 3) 珍珠

的形成机制; ( 4) 双壳类肿瘤的形成机理; ( 5) 多种

螺类是人类寄生虫的中间宿主, 为研究寄生虫和宿

主的相互作用, 提供有效的实验工具。

软体动物细胞培养的对象主要是一些养殖的双

壳类和腹足类, 包括贻贝、珍珠贝、牡蛎、蛤蜊、螺和鲍

等。所培养的组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、

神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。所培养的细胞

已应用于神经生物学、生物监测、肿瘤生物学、免疫和

寄生生物学等方面。

19 世纪70 年代, 软体动物细胞培养就已取得了

可喜的进展。1974 年, Machii

[ 21]

在珍珠牡蛎外套膜

组织培养中, 成功观察到了体外培养的外套膜细胞

能够分泌有机物和进行有丝分裂的现象。但在随后

的30 多年中, 珍珠牡蛎的外套膜组织培养却一直没

有很大的进展。1976 年, Hansen 等

[ 22]

建立起了第一

个也是迄今为止唯一一个软体动物细胞系: 淡水蜗

牛胚胎细胞系BGE。但是在建立海洋软体动物细胞

系方面, 目前尚无类似的成功报道。另外, 1979 年,

Br ew ster 和 Nicholson 等

[ 23]

成功地将牡蛎的变形细

胞在体外培养了6 个月。

19 世纪80 年代之后, 人们对海洋软体动物的细

胞培养条件, 包括细胞冻存、培养基添加物、培养基质

和细胞分散方法等, 做了大量的探索, 积累了丰富经

验, 但仍然没有解决海洋软体动物细胞的体外长期

存活和成功传代建系的问题, 即使是培养贝类的肿瘤

组织也不例外。近年来, 海洋软体动物原代细胞培养

物的应用研究开始增多。Auffret 和 Oubella

[ 24]

利用

巨牡蛎的血细胞凝集实验来检测外源污染物的毒性

效应。Cor net 等

[ 25]

利用牡蛎的原代培养鳃细胞研究

染色体的复制。另外, 在基因表达研究、病毒研究和

生态毒理学研究等方面也有不少报道。

虽然海洋软体动物的细胞培养目前还是困难重

重, 但是只要我们今后在其原代培养组织的消毒处

理、单细胞分离纯化、培养基、培养基质和细胞增殖等

技术方面获得全面突破, 就有可能实现海洋软体动物

细胞建系的目标。

6 棘皮动物门( Echinodermata)

棘皮动物门包括海星、海胆、海参和海百合等, 均

为底栖海洋动物, 种类不多, 但具有了中胚层起源的

真骨、后口和发达的真体腔等比较高等的进化特征,

是向脊索动物进化中的无脊索动物。棘皮动物的细

胞培养研究开展得很少, 虽然棘皮动物具有无与伦比

的再生能力, 但是其细胞培养还是难获成功, 目前仍

然停留在原代培养的水平上。因而在细胞分离纯化、

培养基、培养条件以及组织来源等方面都需要进一步

的探索。海胆和海星的细胞培养主要是对胚胎细胞

的原代培养。Ermak 和 Odintsova

[ 26]

报道了贴壁因

子对体外培养海胆胚胎细胞的生长和分化的影响。

培养基质可影响海胆胚胎细胞的分化。体外培养海

胆原肠期幼虫细胞1 周后, 开始有上皮细胞和间充质

细胞的分化。不过, 上皮细胞在多聚赖氨酸培养基质

上优势生长, 而间充质细胞则在添加有纤连蛋白和癌

沉淀素 A( oncoprecipitin A) 的培养基质上优势生长,

并形成合胞体或细胞团。棘皮动物某些细胞类型在

培养过程中易聚集形成细胞团( aggr egate) , 或相互融