摘要：

蝉花(Cordyceps cicadae),又名金蝉花,是我国一种传统名贵中药材,是蝉拟青霉(Paecilomyces cicadas)感染寄生蝉科昆虫而形成的虫菌复合体。蝉花的重要生物活性物质包括核苷类成分,多糖,虫草酸,多球壳菌素等,具有抗肿瘤,免疫调节,保护神经,改善肾功能,降血糖,抗菌等广泛的药理作用。抗肿瘤功能是蝉花的重要的药理作用之一,但其相关的作用机制缺乏系统研究。同时由于天然蝉花资源渐趋枯竭,远不能满足市场日益增长的需求。基于以上问题,本论文对蝉花活性成分抗肿瘤作用及其机制,以及用家蚕蛹作为替代寄主人工培育技术进行了研究,主要研究结果如下:1,采用蒸馏水和乙醇两种常见溶剂提取蝉花有效成分,分别得到蝉花水提物(WEC)和蝉花醇提物(Ethanolic extract of Cordyceps cicadae,EEC),再采用MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,噻唑蓝)法分别检测WEC和EEC对癌细胞活力的影响,发现WEC和EEC对胃癌细胞SGC-7901的细胞活力均有明显的体外抑制作用,其中EEC的体外抑制作用更强。

在对EEC敏感的肿瘤细胞株筛选中,发现EEC对SGC-7901细胞,H1299细胞,HeLa细胞,HepG2细胞和A549细胞均具有细胞毒性,其中对胃癌细胞SGC-7901的毒性最强。2,通过细胞凋亡测定,细胞周期测定,线粒体膜电位变化测定,胞内Ca2+水平测定和Western blotting等实验,发现EEC处理可引起SGC-7901细胞凋亡,S期阻滞,MMP(Mitochondrial membrane potential,线粒体膜电位)去极化和Ca2+水平过载,这些都可能是EEC抑制SGC-7901细胞生长的有效途径。此外,EEC能分别调控细胞凋亡,细胞周期以及内质网应激的相关蛋白在SGC-7901细胞中的表达水平,揭示EEC主要是通过激活caspases家族介导的细胞凋亡途径,来诱导SGC-7901细胞凋亡以及调节细胞周期,内质网应激相关调控因子表达,从而发挥其体外抗肿瘤作用。3,采用苯酚-硫酸法,BCA蛋白含量测定法,高效液相色谱法测定EEC中活性成分,发现EEC中总糖含量为211。6 μg/mg,蛋白含量为336。5 μg/mg,核苷类物质有腺嘌呤,尿苷,腺苷,N6-(2-羟乙基)-腺苷(N6-(2-Hydroxyethyl)-adenosine,HEA),其含量分别为 1。

841±0。007μg/mg,6。015±0。018 μg/mg,1。774±0。030μg/mg,5。388±0。019μg/mg。MTT法检测发现,腺嘌呤,尿苷,腺苷和HEA对SGC-7901细胞生长均有抑制作用,其中HEA的抑制作用最强。4,通过CCK-8实验,细胞凋亡测定,细胞周期测定,ROS(Reactiveoxygen species,活性氧)水平测定,MMP变化测定,Ca2+水平测定,细胞自噬水平测定和Western blotting等实验,发现HEA对胃癌细胞SGC-7901和AGS均具有体外抑制作用和促凋亡作用,HEA能诱导SGC-7901细胞的ROS产生和MMP去极化,触发caspase依赖性细胞凋亡,通过Ca2+调节诱导内质网应激,诱导细胞自噬并产生S期细胞周期阻滞。5,采用基因表达谱技术探究HEA体外抗肿瘤作用机制,发现HEA诱导SGC-7901细胞产生差异基因,这些差异基因参与细胞凋亡,细胞周期阻滞,内质网应激,细胞自噬等。GO富集分析和KEGG通路分析表明,HEA上调或下调基因主要参与癌症发生发展相关的多种信号通路。6,建立SGC-7901细胞实体瘤裸鼠模型,灌胃法给药,探究HEA的体内抗肿瘤功能,发现HEA可呈剂量依赖性地抑制模型裸鼠肿瘤大小和重量的增长,诱导肿瘤组织坏死与细胞凋亡,从而实现体内抗肿瘤作用。7,用组织分离法从天然蝉花体中分离纯化出蝉拟青霉,采用体喷法将分生孢子接种于蚕蛹体,模拟天然蝉花生长的生态环境条件,人工培育出"金蚕花",并探明了其适宜的人工培育条件。本研究结果为扩大蝉花的药用和保健作用范围提供了理论依据,也为蝉花代用品的开发利用奠定了基础。

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