陶挺1 苏松坤1 陈盛禄2 杜宏沪1(1.浙江大学动物科学学院杭州310029；2.浙江大学农业与生物技术学院杭州310029)
摘要：蜂王浆是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供3日龄以内蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物质，具有多种生物活性。王浆含有丰富的蛋白质，通过直接分离纯化王浆中的蛋白质分子，或通过王浆蛋白基因克隆表达以获得表达产物，进而研究王浆蛋白的功能。研究发现王浆中含有多种具有特定功能的蛋白质，如MRJP3具有免疫调节作用，Jelleine-FⅣ及Royalisin具有抗菌作用，MRJP1具有抗肿瘤功能及可能的蜜蜂行为调节功能，57kDa蛋白及Apisiin的促细胞生长功能，57kDa蛋白具有抗疲劳功能等。随着王浆蛋白组分分离、基因克隆表达及其功能研究的深入，王浆蛋白将被应用到生物医药、细胞培养、组织工程等更多的研究领域。
关键词：蜂王浆，MRJPs，生物学功能
蜂王浆(royaljelly，RJ)是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供3日龄以内蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物质。蜂王浆中一般含水量为64.5%~68.5%，蛋白质12%~14%，碳水化合物8.5%~16%，脂类6%，灰分0.4%~2%，其它物质2.84%~3%。其中王浆蛋白由水溶性。蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46%~89%，为王浆蛋白的主要部分，称为主要王浆蛋白(majorrbyaljellyproteins，MRJPs)
由同一只蜂王产下的受精卵发育成的幼虫若在整个幼虫期都喂蜂王浆，只需16天就发育成性器官完全的蜂王；若在前3天喂蜂王浆，之后喂蜂粮(蜂蜜和花粉的混合物)，21天后才发育成性器官不完全的工蜂。蜂王在繁殖高峰期，每天的产卵数达到2000粒，超过自身的体重。蜂王浆神奇的功效引起了许多科学家极大的兴趣。
早在1792年，弗郎克斯·哈伯(FrancoisHuber)就提出王浆一词；此后一直到20世纪20年代，加拿大一养蜂者随意将蜂群中多余王台削下来被母鸡吃掉，第2天母鸡产下一个较大鸡蛋，这一发现引起了科学家的注意。从此，蜂王浆研究和利用的历史事例越来越多，但对蜂王浆进行包括生物学、化学、药理和临床实验的全面研究，还是最近几十年才开始的，至今人们对蜂王浆中的一些微量生物活性物质还未完全研究清楚。
蜂王浆的许多功能由其所含的蛋白组分产生，但由于其组成复杂，且有些成分在分离过程中易失活，因此很多研究都集中在王浆整体水平上，而未阐明王浆为什么会有这些功能，怎么产生这些功能，是哪种组分产生了这些功能；受试对象也主要集中在动物个体水平，而鲜有达到细胞分子水平。对王浆蛋白单一组分研究的缺乏限制了其应用范围，近年来，随着基因工程、分子生物学、蛋白质组学及现代分析、分离技术的发展，一些蛋白组分已经得到分离5~1或在大肠杆菌中得到表达并进行了功能实验，这对进一步阐明王浆蛋白组分的生理生物活性，扩大其应用范围，无疑是具有重要意义的。
1、王浆蛋白的生物学功能
蜂王浆整体水平功能研究的全面铺开已有几十年的历史，主要表现为免疫调节、抗菌、抗氧化(-、抗肿瘤、促细胞生长、促繁殖、抗皮劳、降血压、预防骨质疏松声周、营养神经等功能；近几年来，王浆中的某些单一蛋白组分，如MRJP3、Jelleine-FⅣ、Royalisin、MRJP1、57kDa蛋白、Apisimin等也己得到分离或表达并进行了功能实验。
1.1免疫调节功能
早在1996年，Lidija等就发现王浆通过刺激抗体产生和免疫活性细胞增殖而起到免疫调节的作用，但人们还不知道到底是何种组分发挥了作用。在随后的研究中，人们还发现王浆能抑制DNP-KL.H小鼠的过敏反应和NC/Nga小鼠特应性皮炎样病变。但是只有Okampto等的研究揭示了MRJP3的抗过敏作用。他们通过OVA/alum免疫小鼠经anti-CD3刺激衍生的脾细胞抑制IL-4的产生从王浆中筛选抗过敏因子，采用一系列柱色谱分析，分离纯化了一个70kDa的糖蛋白，即MRJP3。体外试验表明，MRJP3不仅能抑制L-4的产生，还能通过抑制T细胞增而抑制L-2和lINy的产生。更有意思的是，MRJP3作为外源蛋白本身具有抗原性，经腹膜注射能抑制免疫小鼠血清anti-OVAlgE和IgGl的水平，而热处理能降低其抗原性。这些结果表明MRJP3在体内外均有免疫调节的作用并可能会被应用于临床治疗。
1.2抗菌功能
Fontana等从蜂王浆中分离了4种抗菌肽，这些抗菌肽属于同一个蛋白质家族Jelleines，并分别命名为Jelleine-I、Jelleine-II、Jelleine-ⅢII、Jelleine-Ⅳ。研究人员通过氨基酸测序，体外合成、纯化，进行了一系列的生物学实验。他们通过测定抗菌肽的抗菌活性、肥大细胞脱颗粒活性和溶血试验，发现Jelleine-FII对酵母、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有特异性抗菌作用，而Jelleine-Ⅳ在所有的试验中均表现抗菌性。这些抗菌肽与蜜蜂体内的其它抗菌肽没有任何相似之处，它们由工蜂产生并分泌到王浆中。研究人员通过数据库，还发现Jelleine-IIC-末端9个氨基酸序列与王浆中MRJP1C末端9个氨基酸序列完全一致，提示Jelleine-ⅡI可能是MRJP1经胰蛋白酶作用后的产物。通过胰蛋白酶部分具蛋白质外切酶活性片断的作用，MRJPI还能形成Jelleine-I和Jelleine-Ⅳ，提示MRJP1可能是Jelleine的前体物质101。Bachanova等报道了王浆中一种新的抗菌多肽Royalisin，并发现Royalisin对蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原(Paenibacilluslarvaelarvae)及其他受试革兰氏阳性菌有抑制作用。
1.3抗肿瘤功能
Bincoletto等在2005年发现王浆能阻碍因肿瘤细胞生长而导致的骨髓抑制，但成分未知。Majtan等运用基因工程的方法，在体外表达了重组的Apal(MRIPI)并进行了功能实验，发现其能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子(TNE)。令人感兴趣的是，重组Apal经胰蛋白酶部分消化后，其免疫刺激功能显著增强。相关实验表明，Apal的N-端重组片断较其它3个蛋白片断活性最强.
1.4促细胞生长功能
Kamkura等研究了王浆57kDa蛋白的生理学作用，他们通过对大鼠原代肝实质细胞的培养，发现57kDa蛋白能显著地促进肝细胞的DNA合成，而常用的牛血清却无此作用。此外，57kDa蛋白还能增加清蛋白(亦叫白蛋白)的合成，促进细胞增殖，提示57kDa蛋白可能起到细胞分裂素的作用。随后，57kDa蛋白的作用机理也被阐明。2002年被Blkova等人发现的小肽Apisimi在随后的实验中也被证明有刺激人单核细胞增殖的作用。
SalazarOlivo等从王浆中提取粗蛋白(RJCP)并发现其能刺激昆虫Tn-5B1-4细胞生长，每毫克蛋白添加剂能使细胞数量比对照组多6.5倍，而通常用的胎牛血清却只有2.55倍，这些粗蛋白与用硫化胺从王浆中沉淀的RJPo和RJPoo效果一样，都能影响细胞的形状，刺激细胞的粘附。RPo能够刺激鼠科动物的3T3-F442A前脂肪细胞转化为成熟脂肪细胞，其效果比胰岛素好2倍，粗蛋白和RJPoo也有类似效果。RJPo还能对海拉人类子宫癌细胞产生生长抑制作用，用RJP处理7天后，细胞数目减少2.5倍。以上结果表明了王浆蛋白对于细胞生长作用的多样性，它对昆虫、鼠科动物和人类癌细胞分别有促生长、促分化和抑制生存的作用，
1.5其它功能
鉴于王浆蛋白组分的复杂性，其功能也呈现多样化，Albert等曾指出MRJPs是在进化过程中产生功能分歧的。除了以上几种主要功能外，以下功能也已经见诸报道。
Matsui等报道，完全蜂王浆和它的分离蛋白根本不会阻碍血管紧缩素I-转化酶(ACE)的活性，然而，蜂王浆经胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，其产物具有抑制血管紧缩素的作用，从而起到降血压的作用。采用液相色谱法对王浆水解产物进行分离，获得二肽、三肽片断，并发现了11个ACE的抑制肽，其中有8个肽是首次从自然资源中鉴定出来的。因此，土浆蛋山被认为是种可通过肖肠酶水解状取ACE抑制肽的好资源。Kamakura等报道王浆有抗疲劳作用，这可能与王浆中57kDa蛋白的含量有关。
2王浆蛋白的分子生物学研究进展
20世纪，由于科学发展水平的限制，人们主要采用化学分析的方法对王浆组分进行粗略的分析及王浆整体水平上的功能实验；然而，这些方法已经无法满足功能如此纷繁复杂的王浆蛋白分析的需要。目前，人们迫切需要知道的是在这些复杂的功能背后，到底是何种组分发挥了作用，到底存在怎样的作用机制。
21世纪，王浆蛋白分子水平的研究悄然展开，这得益于现代科学技术的发展。2006年10月26日，Nature》杂志发表了蜜蜂基因组的全序列**；随后，《Science》杂志也在10月27日和12月15日相继发表了3篇评论，指出了蜜蜂基因组序列对于研究昆虫的进化和社会性行为的重要意义-.这一历史性的成果标志着蜜蜂基因组研究工作的大跨越，必将对以后蜜蜂基因功能和王浆蛋白功能的研究产生重大影响。
目前，王浆蛋白的分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族，目前已知的成员有MRJP1，MRJP2-4，MRJPS，MRJP6-8。2007年，Drapeau等报道了MRJP9，还指出了MRIA基因家族中一个新的假基因编码一个不完整的多肽，这个多肽可能成为MRJPs家族的第10个成员，研究人员还将这个基因命名为MRJPf。其中MRJP2，MRIP3，MRIP5基因均存在重复序列多态性；而MRJP3-5，MRJP基因则均存在单核苷酸多态性(SNPs)。
MRJPs包含大量的必需氨基酸，在蜜蜂的营养中起着重要作用。另外，多态重复区域在MRIPS基因家族进化中出现得很早，这也可能与蜜蜂增加自身氮储藏量，保证自身营养有关。在近来的研究中，有关MRJPI的报道频频出现。MRJPI是一个分子量约为56~57kDa的糖蛋白。它具有高度的保守性，且在王浆中含量最丰富。不同于其它家族成员的是，Kncharski等报道MRTP1在蜜蜂大脑的蘑菇体表达，提示MRJP1可能在蜜蜂的行为调控中起作用。
2005年，蛋白质组学技术也被应用到王浆蛋白研究中，Scarselli等用蛋白质双向电泳、质谱、从头测序技术研究了王浆的蛋白质组，发现了MRJP1-3的前体及几个MRJP1和MRJP3的片断，这可能是由于王浆中存在蛋白酶的原因[ω.Santos等同样用蛋白质双向电泳技术，从王浆中分离了61个多肽点，其中34个已经确定，有27个蛋白质是MRIPs成员。
目前，国内围绕王浆蛋白也展开了一系列研究，邢丽苹等克隆并表达了Apisimin；本实验室也在这方面进行了积极的探索，构建了中华蜜蜂Apisceranacerana8日龄的工蜂头部cDNA，成功克隆了编码MRJPI，MRIP2，MRJP3，MRJP5，Apisimin的全长cDNA序列，并对它们的全序列进行了测定与分析。此外，还发现了中蜂MRJP2基因一个新的多态重复区域。
3、结语
在各国科学家的不断努力和探索下，王浆蛋白的功能研究已经取得了不少进展，且已成为当前蜂王浆研究的热点。人类的实践也已证明王浆蛋白的诸多优良生物活性，但鉴于其成分的复杂性和功能的多样化，仍有许多问题亟待解决。分离纯化王浆中的功能蛋白或将王浆主蛋白基因克隆表达并阐明其作用机理，已成为当务之急。现代分析分离技术及基因工程、分子生物学、蛋白质组学的发展和蜜蜂基因组测序的完成，又给这一研究带来了历史性的契机，成为这一研究强有力的工具。我们相信，在全球科学家的共同努力下，阐明蜂王浆蛋白复杂的组分及其功能不再是一个神话。同时，王浆也不仅仅只用于人类保健品和相关药品的生产，更会应用到诸如细肿培芥、幻织工程等领域，促进科学技术和人类社会的发展。
参考文献：（略）
