前言

鉴于有的在非瘟快检操作上有些疑问,这里和大家分享中牧非瘟快检试剂盒操作指南视频,便于大家快速掌握非瘟快检操作要领。

非瘟快检操作视频指南

与此同时,列举了18个快检过程中的问题进行解答,以便有更深入的了解。

01

何为PCR?

PCR,即Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应),是一种体外核酸(DNA)扩增技术。

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PCR原理

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02

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这里可以输入简单的图片描述

PCR技术发展历史如何?

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发展历程

所谓荧光定量PCR技术,利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定性/定量分析。

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03

荧光定量PCR检测方法有什么特点?

Ø 是可以替代病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV检测技术

Ø 同时,相比于抗原检测技术,如酶联免疫吸附试验(ELISA)和直接荧光抗体检测(FAT)具有更高的敏感性和特异性

Ø 被认为是ASFV核酸检测的金标准,被用在OIE所有的区域性参考实验室

Ø 对于特急性、急性或亚急性ASF感染病例,PCR是首选的检测技术

Ø 需要注意的是,PCR的高度敏感性使其容易发生交叉污染,应该采取适当的预防措施来坚守和控制污染风险的发生。

04

官方推荐的非洲猪瘟检测方法有哪些?

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如上所示,目前可用的诊断技术可通过综合病毒和抗体检测来确诊ASF。实时荧光PCR是应用最广泛的病毒学诊断技术,可敏感、特异、快速的实现ASF核酸的检测。

05

国家批准了哪些试剂盒?

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据悉,共有48个企业共计160个产品申报非瘟跨快速检测试剂盒,2019年6月11日中国动物疫病预防控制中心公布了结果,最终通过了26家企业的34个产品,绝大多数通过的试剂盒属于荧光定量PCR类,这也侧面说明该技术的成熟性。

06

快检试剂盒应用范围有哪些?

最关键的也是大家容易忽略的是应用范围:猪血液和猪组织样品快速检测。单列一条,说明它的重要性。很有用户在使用的时候往往陷入这样的误区,期望快速检测试剂盒能够替代实验室检测,比如环境样本检测和某些病毒含量极低的样品。我们要清楚,快速检测试剂盒并不能完全取代专业实验室。

07

什么是CT值?

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可以通俗地理解,在一定范围内,CT值越低,说明待检样品浓度越高;CT值越高,说明待检样品浓度越低。CT值高出一定范围,说明样品为阴性。具体参照各试剂盒说明书。

08

快速检测试剂盒有哪些组成部分?

组成:

ASFV PCR反应液

样本稀释液

混合酶液

ASFV 阳性对照

阴性对照

说明书

不同类型的试剂盒略微有些差异。

09

市售非瘟快速检测有哪几种?

根据分装与否和提取与否这两个指标,市场上可以看到四种不同的快速检测试剂盒,这几种试剂盒本质上没有大的差异,操作方面有所体现。不同的用户群体可以根据情况进行选择。

试剂盒1:预分装+免提取;

试剂盒2:不分装+免提取;

试剂盒3:预分装+常规提取;

试剂盒4:不分装+常规提取。

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简要介绍如上面图表所示。不同用户有不同的追求目标,对于血液和组织样本来说,这四种试剂盒都能满足检测需求。详细来讲,四种试剂盒形成四种检测方案,具体如下:

10

“预分装+免提取”检测方案是什么?

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒(预分装+免提取)的操作方案

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从包装明细可以看出,也就是免提取和预分装的组合。主要特点体现在两方面,一是待检样本不用大型仪器来提取核酸,只需用样本稀释液和样本裂解液进行处理,即可获得反应模板;二是试剂盒的组成,除了阳性对照和阴性对照外,其他如引物、探针、酶、反应液等所用试剂提前装在了小管中,这样操作时就不用一样一样去加了。

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简而言之,帮助操作者简化了几个步骤,也避免了漏加或多加等失误现象。

这也是最为流行,广受用户喜欢的一种检测方案。

不同类型样本检测样本的操作过程如下

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11

“不分装+免提取”试剂检测方案是什么?

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒(不分装+免提取)的操作方案

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如果你看懂了上面一种试剂盒的介绍,现在应该就一目了然了。和预分装的相比,差异就在于多了一管混合酶液。

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其他操作步骤同上类似。

12

“预分装+常规提取”检测方案是什么呢?

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒(预分装+常规提取)的操作方案

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也就是前面提到的试剂盒3:预分装+常规提取。和试剂盒1:预分装+免提取相比,差异就在于样本的核酸提取环节。这种方案差异就在核酸提取这环节,需要另外配备全自动核酸提取仪或者手动提取核酸。这主要体现在某些病毒浓度非常低的样本而言,如环境样本等,要求更精准可以采用这方法。对于血液样本和组织样本来说,这几种试剂盒没有明显的差异。

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不同类型样本核酸提取环节操作如下所示:

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13

不分装+常规提取检测方案是什么?

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒(不分装+常规提取)的操作方案。

从包装明细可以看出其细微差异。其他操作类似。

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14

不同环境下PCR扩增程序是否有差异?

这里分快速扩增程序和标准扩增程序。前者适用于便携式的快速扩增设备,后者适用于专业实验室的设备。详细扩增程序如下:

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15

中牧试剂盒的性能如何呢?

一方面可以通过浓度梯度测试,把样品进行梯度稀释后,看扩增曲线图是否“优美”。如下图就是比较理想的梯度测试结果。

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二是测试试剂盒的特异性和灵敏度。

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三是可以通过对相同样本,采用不同的试剂盒来对比,看检测结果如何。如下图,前者性能优于后者。

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16

中牧试剂盒最低检出量是多少呢?

这可以通过设计试验来验证。比如:用浓度为5×103copies/uL的ASFV的P72全长标准质粒作为待测样本,通过梯度稀释,测试非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒(预分装+免提取)的灵敏度,看其最低检出量。

如下设计:

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模板浓度分别5copies/ul、50copies/ul、500copies/ul、5000copies/ul,上样量为2.5uL。

按说明书操作,结果如下:

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结论:ASFV P72稀释3个梯度后,结果曲线图如上所示,模板浓度为5copies/ul(上样量12.5copies)的ct值约为38,根据判定依据,结果为阳性。换句话说,待测样本的模板浓度≥5copies/ul,即可检出阳性,灵敏度相当高。

17

快速检测试剂盒操作常见注意事项有哪些?

1.在操作中,应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性移液器吸头(带滤嘴自卸式);不能用手直接触摸PCR反应管底部。在试剂准备和标本处理时应使用生物安全柜(负压式)或防污染罩,以防止对环境的污染。

2. 离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用75%乙醇擦拭消毒;每次实验前后用10%次氯酸或75%乙醇擦拭移液器、操作台。

3.实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应该妥善放置,专人保管;废弃物应置专门容器中,妥善处理。

4.荧光探针试剂应避光保存,加入反应液体后,应尽快配置好反应体系进行扩增。

5.配制反应体系时,应注意移液器的使用方法。所有的液体应加样于近液面处;液体的混匀不能使用移液器吹打。

6.配制反应体系过程中若需标记,请在PCR反应管两端管盖两端多余部位标记,不要标记在PCR管上。

18

还有其他注意事项吗?

对于已经预分装的试剂盒,操作要注意以下几点:

1、加样本前:

1)计算当次实验所需要的反应数,取等量的8联PCR反应管(内装有PCR反应液)。剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存;

2)为避免试剂附着在管壁上,试剂在使用前于2000rpm离心10 s。

2、加样本时:

1)打开PCR反应管盖,建议用镊子逐个开启,避免液体飞溅。

2)沿壁加样,勿接触到反应液。

3、加样本后:

盖好PCR反应管盖, 2000 rpm 离心10 s以去除管壁附着液体。

结语

中牧股份始终坚持在抗击重大动物疫病、保持养殖业健康发展等方面发挥“国家队”和“主力军”作用。生物制品事业部必不忘品质初心,牢记央企使命,积极践行“以新担当应对大变局,以新作为推进大变革”的要求,为推动公司高质量发展注入了新的动能和活力。

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