摘要：

本课题以灰树花菌株Gf-3为材料,通过液态深层发酵,从其发酵菌丝体中提取得到灰树花β-葡聚糖合成酶[Grifola frondosa β-glucan synthase (GFβGS)]粗酶,经过分离纯化得到灰树花β-葡聚糖合成酶,并对其酶学性质进行了研究。 使用超声波细胞破碎法将灰树花发酵菌丝体细胞破碎,离心收集上清液。向离心上清液中加入沉淀剂对灰树花β-葡聚糖合成酶进行分级沉淀,静置后离心,收集沉淀,得到灰树花β-葡聚糖合成酶的粗酶。分别使用不同浓度的丙酮,硫酸铵和乙醇作为沉淀剂,以沉淀得到的灰树花β-葡聚糖合成酶的比活和蛋白质含量为指标,筛选出最适合灰树花β-葡聚糖合成酶的沉淀剂及其浓度。试验结果表明,使用饱和度为60%的硫酸铵沉淀出来的灰树花β-葡聚糖合成酶中杂蛋白的含量低,纯度比较高。 将灰树花β-葡聚糖合成酶的粗酶连续进行两次重结晶,然后经过非变性电泳进一步纯化后,灰树花β-葡聚糖合成酶达到电泳纯级别。 灰树花β-葡聚糖合成酶的分子量为55。057KDa。灰树花β-葡聚糖合成酶在30℃到50℃之间最稳定,在5℃到70℃之间比较稳定,在pH=5。0时最稳定,在pH=7。0比较稳定。

灰树花β-葡聚糖合成酶的最适反应温度是15℃,最适反应pH值为5。0。 Ca~(2+),Mg~(2+)和Al~(3+)对灰树花β-葡聚糖合成酶有一定的激活作用;Mn~(2+)能强烈的激活灰树花β-葡聚糖合成酶,在3mmol/L的浓度下,能使酶活达到原来的2。83倍。Cu~(2+)和Ba~(2+)对灰树花β-葡聚糖合成酶有一定的抑制作用;Zn~(2+)和Fe~(3+)能明显的抑制灰树花β-葡聚糖合成酶,4mmol/L的Zn~(2+)和3mmol/L的Fe~(3+)分别能使其酶活降低82%和66。7%。Fe~(2+)对灰树花β-葡聚糖合成酶的活性无影响。 灰树花发酵液中没有灰树花β-葡聚糖合成酶的存在,即灰树花β-葡聚糖合成酶是一种胞内酶,不分泌到胞外。 灰树花β-葡聚糖合成酶的催化方向是单向的,不能逆向催化。灰树花β-葡聚糖合成酶能以葡萄糖为底物催化灰树花β-葡聚糖(灰树花多糖)的合成,不能以灰树花多糖为底物催化其分解的反应。灰树花β-葡聚糖合成酶将消耗掉的葡萄糖完全催化合成了灰树花β-葡聚糖,催化反应的产物中没有淀粉等α结构的多糖存在,催化反应的产物就是灰树花多糖。 本研究可以为进一步研究灰树花β-葡聚糖合成酶的结构和功能奠定基础,也可以为深入研究灰树花多糖合成机制,提高灰树花多糖生产效率提供依据,亦可为新型抗真菌药β-葡聚糖合成酶抑制剂的研究奠定基础。

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