(一）半数致死量(LD5Q)的测定

选20±2g小白鼠，雌雄不拘，分成4组，每组10只，蛇毒按等比级稀释。每只小白鼠腹腔注射0.2ml，24h后观察致死之动物数，用Litchfield和Wilcoxon的统计法计算LD50的值。全数致死剂量LD:。。按相似的方法测定，以最小全数致死剂量为其毒性剂量LDw。

(二）亚急性毒性实验(覃公平等，1986)

该方法一般适用于检测连续用药动物可能产生的副作用，本实验用清栓酶为例。

选40只全系无孕雌鼠，分成5个组，每组大鼠8只，其中设对照组1个，实验组4个。给药剂量以临床用药量为基础（0.004IU/kg)，设临床用药量的1.7倍（0.0069IU/kg)、2.9倍(0.115IU/kg)、5.8倍(0.023IU/kg)及28.8倍(0.115lU/kg)4个组。给药方法为皮下注射，给药时间为临床用药的一个疗程（21天）。用药为每日注射一次，体积为1.0ml，按各剂量组稀释后给药，对照组注射生理盐水。对各组实验动物进行如下观察:①日常行为，如进食、进水、活动状况等;②体重、贤功能（以尿素氮为指标）、血象检查(血小板、白细胞数）;③各脏器组织学检查，方法是用药21天后把40只大白鼠全部处死，进行各脏器的组织学检查、中毒性损伤的病理形态判定。以实质器官细胞的严重变性及坏死作为观察指标，特别是肝细胞及肾曲管上皮细胞，其次是心肌纤维细胞;对血管壁及血液的毒性损伤的病理形态学判定以实质脏器的出血情况为观察指标，包括血管周围血液成分及血浆渗出，特别是以肺、肾作为重点观察脏器，肾脏检查曲管内有无管型形成。

(三）药物代谢动力学测定

在实验的前1天，用高浓度碘化钾溶液灌服家兔甲状腺，静脉注射经1251标记的毒素或组分，然后在不同的时间间隔取血，测定其放射强度。注射同位素标记的毒素5h后处死家兔，分别取各脏器lg测定放射强度。根据牛顿-高斯法编程序，在微机上拟合血液中放射性活度-时间曲线，并计算出药物代谢动力学模型参数。从各脏器、组织的放射性强度，可以知道毒素进入体内的分布及代谢、排泄途径。

(四）出血毒素结合动力学测定

现在有人(韦传宝等，1989)用1251标记出血毒素，研究标记后毒素与肾匀浆组织的结合动力学，从而推断出血毒素在体内是否有特定的作用位点，步骤包括：

出血毒素的标记根据Gumaa(1971)的方法，用1251标记从毒中分离的出血毒素I(AaHI)，AaHI的用量为100Mg，标记后用SephadexG-15把125I-AaHI和游离1251分开。洗脱液为0.05mol/LpH7.4的PBS，流速为36ml/h，每0.6ml收集1

管，放射性强度用FJ-1901Y谱仪测定，对含有125I-AaHI的试管进行收集，3天内用完。

游离1351的测定。取收集的125I-AaHI液lOOfxl，兔血清50/xl,15%三氯醋酸200M1沉淀离心，测定上清液的放射性强度。上清液的放射性由游离1251引起，游离1251产生的放射活性应小于5%。

家兔肾匀浆组织的制备用空气针处死家兔，取出肾，冷冻至一1CTC，每个肾加

5ml预冷(4。0的BufferA，然后在匀浆器上以3OOOr/min速度匀浆5min。每个肾匀浆组织加20ml预冷(4°C)的BufferA，用两层纱布过滤，滤液在500r/min条件下离心lOmin，弃去上清液，沉淀混匀后即为肾勻浆组织。其他勻浆组织也按类似的方法制备。

3.结合动力学的测定所有反应体系都含有肾匀浆组织BufferA和125I-AaHI。在测定AaHI对125I-AaHI的竞争结合作用时，反应体系还含有未标记AaHI。当结合反应完成后，对反应液进行离心，弃去上清液，沉淀用BufferA洗3次，每次lml，把洗涤后的沉淀从Eppendorf管转移到同位素测量管中，用FJ-1901r谱仪测定其放射强度，数据以曲线的方式表示。用这种方法可以测定不同组织和125I-AaHI的结合强度，肾匀浆组织与125I-AaHI结合的时间饱和值，浓度饱和值和AaHI的竞争结合强度。

从125I-AaHI与肾组织结合的时间饱和曲线可以知道，125I-AaHI结合作用在lmin内达到饱和。用不同量的125I-AaHI(s)和一定量的肾勻浆组织结合30s，用高速离心法中止反应，经洗涤后测放射强度(v)，以|对|作图，从曲线中可求出KD和VMX值。

(五）测痛方法

蛇毒中有不少组分可以引起疼痛和止痛，建立定量的测痛方法十分必要。测痛方法有多种，这里介绍电刺激鼠尾——嘶叫法(印其章，1979)。测定前1天〜4天注射蛇毒组分，测定时先将动物安放于特制的固定架上，待动物安静后测定基础痛阈。然后根据分组要求按计算好的药物量进行微量注射，完毕后5min、lOmin、15min、20min、30min、40min及60min时各测痛1次。为了避免反复过强电刺激引起鼠尾组织损伤，规定较高刺激强度为1.OmA，如果强度已达1.OmA而动物仍不嘶叫则立即停止刺激，并以1.OmA作为此时的痛阈。镇痛效应用镇痛指数A/)来表示，

另一种比较简单的方法称作甲醛爪内注射——行为法（简称为甲醛法，邸石等人，1981)，在大鼠右侧前爪背面皮下注射5%甲醛溶液50)ul，注射后半小时将动物置于特制的有机玻璃箱内观察其行为反应，根据动物注射爪和地面的相对位置，将疼痛程度分为四级：

0级一两前爪均匀对称地置于地面,活动无异常；

I级一注射爪轻微接触地面，活动时明显跛行；

I级一注射爪抬起，不接触地面；

I[级一舐咬或摇动注射爪。

实验时，每分钟观察15s，记录该15s内出现的较高痛级，连续观察30min，将记录到的痛级按时间顺序计算各30min时间段内的痛级的均值，以此作为痛级均数，PIR用以衡量镇痛效应，PIR越小表示镇痛作用越强。

(六）水肿诱导活性测定

把15g〜18g的小鼠分成若干组，每组4只〜6只，把待测组分或蛇毒溶于生理盐水内，配制不同浓度溶液。在小鼠后腿的足垫部位进行注射，注射的体积为20/xl，45min后用断脑法处死小鼠，在踝关节处把双脚切下分别测其重量，由水肿造成的重量增加可以用水

370中国毒蛇学

肿率来表示。水肿率按下式计算:

把引起水肿率120%的剂量称为最小水肿剂量。

(七）蛇毒组分金属离子含量的测定

用原子吸收光谱法测定蛇毒组分所含的金属离子种类，以透析液为对照，所有的溶液都是绝对用无离子水配制的。原子吸收光谱仪——有WYZ-I型光谱仪(中国.沈阳)等。通常都是测定透析前后样品原子吸收光谱并进行比较，透析液为内含螯合剂的缓冲液(如Tris-HCl)，一般用邻-菲咯啉作为螯合剂。透析作用在4X：条件下进行72h左右，其间换4次〜6次透析液。样品中的螯合剂可以用SephadexG-25柱层析除去。

可以测定除去金属离子后样品的活性，从而可以搞清金属离子在维持活性方面的作用。

(八）人血小板悬液的制备

在测量蛇毒中血小板功能抑制因子或激活因子时，经常需要血小板，这里介绍血小板的制备方法：人血液和EDTA轻轻地混合，EDTA的最终浓度为3mmol/L，在90g的条件下离心lOmin，上清液在500g的条件下离心lOmin，血小板沉淀下来，血小板用不含Ca的PBS(pH7.4)洗2次，洗后的血小板悬浮于同样的溶液中。

(九）血小板中环核苷酸的测定

有些血小板功能抑制因子对血小板中cAMP和cGMP的含量产生影响，测定方法如

下：

血小板中cAMP和cGMP的测定按Zhang等(1980,1983)的方法进行，在这里略作修改。0.5ml的人血小板悬液和抑制因子混合，在37°C下保温15min，对照用PBS代替抑制因子。反应完毕后加高氯酸并在80°C温度下加热5min中止反应，然后在1200g的条件下离心lOmin，上清液用KOH中和并重新离心，最后上清液在一45°C下贮存。cAMP和cGMP的含量用放射免疫测定的方法进行，其过程按同位素标记物所附的说明书进行。

(十）回肠纵、环肌标本的制备

用豚鼠25只，体重250g〜350g，兔15只，体重1.5kg〜2kg，雌雄不拘。猛击其头部致昏后，立即由距回盲部20cm处起，向上截取回肠15cm，用Kreb’s液冲洗干净，制备纵肌和环肌标本。制备标本按K0SterlitZ(1970)法，把纵肌和肌间神经丛从肠壁上分离下来，称为分离纵肌标本(实为肌间神经丛纵肌，MPLM)。将肠壁的剩余部分沿环肌走行的方向，交错对切，切成的肌条即为分离的环肌标本。因该标本内的横向环肌经交错对切后，已改

为纵向对接排列，故便于记录收缩反应。

(十一）环肌收缩反应的记录

将欲对比观察的2个肠肌标本同时安放在一个容积为7ml的浴槽内。浴槽内充满改良Kreb’s液，通95和52,恒温37°C。2个标本悬挂在一对铂金电极之间。因2个标本在同一浴槽内，故药物的作用条件是相同的。2个肠肌标本的收缩反应分别通过2个换能器输入LM12-YT多道记录仪上，同时记录，观察并对比收缩速度、频率的变化。凡进行比较的数据均作t检验处理。

(十二)免疫酶标电子显微镜样品的制备(何华平等，1988)

为了确定毒素在体内是否存在特异性结合，免疫酶标电镜法是一种有效的方法，下面以从A^⑶加蛇毒中分离的出血毒素I(AaHI)为样品，介绍酶标电镜样品的制备。

家兔致死后迅速解剖腿肌，取一小块立刻投入经液氮预冷的正己烷中，稍后用锋利刀片将肌块修成约2mmX5mmX7mm小块，控制厚度在25/ini进行冰冻切片，蒸馏水中迅速展片后捞到载玻片上，放潮湿培养皿中，将经辣根过氧化酶标记的AaHI(简称HRP-AaHI)滴在组织切片上，浸没处理lh后用0.2mol/LpH7.2PB充分漂洗，加入HRP底物、H202和3,3^二氨基联苯胺四酸盐，显色30min，用0.2mol/LpH7.2PB充分漂洗，经过常规电镜制片过程，最后在HITACHI800型分析电镜上观察。

HRP-AaHI用过碘酸氧化法制备(朱培坤等，1983;Nakane等，1974)。反应用5mgHRP和5mgAaHI,标记后用SephadexG-75把HRP-AaHI和游离AaHI、HRP分开，洗脱液为0.02mol/LPBS(pH7.2),流速为8ml/h，每2.5ml收集一管。