马上就要研二的小白一个，从6月底开始差不多做了1个月左右的CCK8毒性实验，总结了一下这1个月左右的经验心得，希望可以帮助到大家，有不足的地方也欢迎交流！
①CCK8的原理和应用
CCK8简单来说其实就是试剂中WST8可以与细胞中的脱氢酶作用生成水溶性的黄色甲瓒染料，然后通过测量吸光度可以得出细胞的活性数据，具体可以应用于测量细胞的增殖变化和毒性耐药变化等方方面面！
CCK8原理图
②CCK8实验的流程
下面主要说的是我自己做CCK8毒性实验的流程，各个实验室可能会有不同
（1）实验前一天在六孔板或6cm皿中接种细胞，条件是第二天实验时可以达到理想的汇合度
（2）吸去培养中的培养基，PBS冲洗一遍
（3）胰酶消化细胞，消化至合适的程度时弃去胰酶，加入培养基终止消化，将细胞吹打下来打匀
（4）取一定量细胞用血球计数板进行细胞计数，计算细胞液浓度
（5）按照细胞计数的结果和需要的细胞数量配置相应浓度的细胞悬液，接种至96孔板当中
（6）将96孔板放到培养箱中孵育，孵育时间一般为细胞倍增一次的时间（通常24h即可）
（7）按实验设计的药物浓度加入药液，培养箱孵育（孵育时间按照实验设计的时间来做，24h、48h或其他均可）
（8）弃去培养板中的培养基，按照CCK8：培养基为1：9的比例在96孔板中加入CCK8试剂
（9）培养箱孵育，一般孵育1h或2h均可
（10）酶标仪测450nm吸光度，进行数据计算
③CCK8实验心得
这里我按照上面我的实验流程来逐条讲述下自己的心得体会
（1）实验前一天在六孔板或6cm皿中接种细胞，条件是第二天实验时可以达到理想的汇合度
*这里我一般会选择用6cm皿，让6cm皿细胞长满，一是比较容易判断细胞汇合度，二是在我后续的操作中这个浓度比较合适
（3）胰酶消化细胞，消化至合适的程度时弃去胰酶，加入培养基终止消化，将细胞吹打下来打匀
*这里在胰酶消化细胞完毕弃去胰酶后，我会选择用1ml的培养基将细胞吹打下来，然后弃去800微升细胞液（可以选择传代），再加入2ml的培养基稀释细胞液，这样可以保证在我的实验中细胞液达到一个比较理想的浓度（我做的是某癌症细胞，做7个药液浓度，每个浓度做5个复孔，总共30个孔，每孔接种4000个细胞，细胞液是绰绰有余的）
*这一步我会选择稍微加长一点胰酶的消化时间，一般来说细胞镜下变圆或者有少许细胞脱落下来即可终止消化，我会选择在这个程度上再增加一点消化时间，因为之前我做过一次消化时间有点短，计数时发现细胞团较多影响计数
（4）取一定量细胞用血球计数板进行细胞计数，计算细胞液浓度
*这里要争取保证细胞计数在100~200之间，200多一点也可以，这样做的好处有两点：一是细胞计数的时候不会过于头疼，我刚开始做cck8的时候总是担心细胞过少，所以稀释力度不够大，结果技术时四个大方格总共有三四百个细胞，数的头疼死了；二是按自己的需求配置细胞液的时候误差不会过大，因为细胞原液再怎么吹匀肯定还是有分布不均的，这时候如果细胞原液浓度过大，一点点的计数问题就可能会带来较大的加样误差
血球计数板
（5）按照细胞计数的结果和需要的细胞数量配置相应浓度的细胞悬液，接种至96孔板当中
*接种时可以选择设计4~5个复孔
*接种时有一个操作非常重要！！！！！！因为细胞悬液里的细胞沉降速度非常快，所以先要把细胞悬液颠倒混匀数次（这里我是用的5ml离心管，效果还是比较理想的），然后在接种每个孔时先用移液枪吹打几次确保细胞液混匀，接种时离心管尽量斜着拿，这样可以避免一些细胞的沉降，否则复孔之间误差会很大！
*加入细胞悬液的时候我一般不会把移液枪打到底，因为这样会产生一些小气泡，对于96孔板来说，因为孔的底面积比较小，一些很小的气泡都会导致细胞聚集在一起，所以我一般不会选择把移液枪打到底。我有一次把移液枪打到底发现气泡让细胞分布非常不均，然后拿了一个针头酒精灯烧红后一个个把气泡都戳破了
*96孔板最外面一圈因为边缘效应我一般不使用，个人觉得数据误差较大，我会用等体积的PBS封死，不过我们实验室也有人是选择使用的，这点见仁见智
（5）按实验设计的药物浓度加入药液，培养箱孵育（孵育时间按照实验设计的时间，24h、48h或其他均可）
*这一步我会选择将药液浓度配成设计浓度的两倍，然后等体积加入到96孔板当中，这样就是设计的浓度了，好处是不用再将原来的培养基弃去，比较方便
（8）弃去培养板中的培养基，按照CCK8：培养基为1：9的比例在96孔板中加入CCK8试剂
*这一步弃去培养基有两种方法
1.我自己是选择的这个方法，用移液枪将板内的培养基一个个孔吸过来，将培养基弃去，好处是我觉得这样培养基吸去的比较完全，残余较少，对CCK8的实验影响较小，缺点是操作比较繁琐，比较累，而且和枪头接触的一小部分细胞有可能会被吸掉（我自己的细胞反正是被吸掉了，有些细胞可能贴壁较牢固所以我不大了解，建议如果用枪吸完了还是去镜下观察一下），如果有排枪的话可以省去一定的工作量
2.直接将培养板内的培养基全部甩去，然后将残余的培养基在吸水纸上吸干，吸水纸应该先喷酒精消毒避免污染，这样做的好处是操作比较方便，但我个人这样操作后觉得不可能将培养基完全弃去，对后续CCK8的测定结果影响较大，会造成复孔之间结果的差异，但我们实验室是有人这样做然后结果还是很理想的，只能说可能我自己技术太菜，见仁见智
*对于加入试剂较多的实验，可以选择先将CCK8和培养基配好再加入到96孔板当中
*加入CCK8的时候要避免气泡是老生常谈了，我会选择不把枪打到底，也可以选择把枪打到底，产生的气泡用针头烧红戳破即可
总的就分享到这里，我自己也是个刚接触实验不久的小白，写这个帖子不仅仅是为了分享，也是给自己做个总结，大家有兴趣或者不同意见欢迎一起讨论，谢谢！