本发明属于蚯蚓养殖技术，具体涉及一种蚯蚓养殖技术的优化方法。
背景技术：
蚯蚓是一种常见的杂食性无脊椎动物，在土壤系统中分布广泛，占陆地无脊椎动物总生物量80％。经测定蚯蚓主要由蛋白质、不饱和脂肪酸、碳水化合物、维生素、钙和磷等元素组成，营养丰富。在医学上具有清热、平肝、止喘、通络的作用，在农业生产中可作为畜、禽、鱼类等养殖的蛋白质饲料，并在改善土壤、循环利用矿物质和有机质以及维持土壤结构方面发具有重要的作用，还可处理城市和农村生产生活中的有机垃圾，化废为肥，改善环境，具有极高的利用价值和生产效益。蚯蚓粉及蚯蚓体腔液的脂肪中含有油酸、亚油酸、棕榈酸、豆蔻酸、月桂酸、葵酸等不饱和脂肪酸，可提高脑细胞活力并增强记忆能力和思维能力。因此，蚯蚓的应用越来越广，我国蚯蚓养殖产业发展快速。
目前，蚯蚓的主要食物是畜禽粪便。昝林森等研究发现牛粪、羊粪和猪粪等均可用于养殖蚯蚓，其中牛粪养殖蚯蚓效果最佳，经济效益最高，为蚯蚓养殖产业常用的养殖饲料(昝林森,等.集约化养殖场畜禽粪便蚯蚓资源化处理技术与模式.全国农业面源污染与综合防治学术研讨会论文集.2004.)。成钢等研究发现畜禽粪便经发酵腐熟后可用于养殖蚯蚓，其以蚯蚓在不同畜禽粪便基料中的生长速度、养殖后的蚯蚓大小、产茧量和孵化率为考察指标，发酵后的牛粪养殖蚯蚓为对照，采用发酵后的猪粪、兔粪、鸭粪和羊粪等畜禽粪便养殖大平三号蚯蚓，研究不同基料对蚯蚓生长繁殖的影响，结果表明，大平3号蚯蚓用猪粪养殖生长速度和蚯蚓大小显著高于牛粪组，且兔粪、鸭粪和羊粪组蚯蚓生长正常，可以用于养殖蚯蚓(成钢,等.太平三号蚯蚓对家畜粪便利用效果比较研究[j].家畜生态学报,2015,36(5):77-80.)。在我国蚯蚓养殖主要是以牛粪养殖饲料为主，此养殖饲料存在食用卫生和安全的隐患，随着社会和经济的发展，牛的养殖产业受到环境和区域的限制，导致某些地区的用于蚯蚓养殖的牛粪资源短缺，蚯蚓养殖成本提高，已严重制约蚯蚓产业的发展，急需研发能替代牛粪的蚯蚓养殖新饲料及相对应的蚯蚓养殖新技术。
本发明人前期研究发现，金针菇菌渣和醋渣经多菌固态发酵后，可用于养殖蚯蚓，养殖效果优于果皮饲养和牛粪饲养，且此饲料价廉易得、组分简单。但此金针菇菌渣和醋渣发酵产物用于蚯蚓养殖技术未见文献报道。其养殖技术的优化也未见文献报道，亟待研究。研究发现，蚯蚓养殖过程中其养殖饲料中的水分含量、养殖温度、初始ph值养殖密度等均能影响其生长繁殖性能(王定国,等.添加em菌对蚯蚓在畜禽混合粪便中处理效果的影响.猪业科学,2017,34(10):87-90.)。本发明采用响应面法研究金针菇菌渣和醋渣发酵产物养殖蚯蚓技术及优化，获得适宜金针菇菌渣和醋渣发酵产物养殖蚯蚓的技术。
技术实现要素：
本发明提供一种蚯蚓养殖技术的优化方法，该技术用于养殖蚯蚓，本发明针对新蚯蚓饲料-金针菇菌渣和醋渣资源化利用的问题，采用金针菇菌渣和醋渣发酵产物养殖蚯蚓，响应面法优化其养殖方法，获得适宜蚯蚓生长的养殖技术，使价廉易得、组分简单的蚯蚓饲料得到资源化高效利用，并解决了其环境污染问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种蚯蚓养殖技术的优化方法，包括以下步骤：
养殖饲料发酵：将热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的混合菌液接种到金针菇菌渣和醋渣的混合原料上，在发酵条件下发酵后得到发酵产物；
蚯蚓养殖条件优化：将蚯蚓以养殖密度为16～24条/dm3投入预先放置新鲜湿润泥土的养殖器皿中，分别加入所述发酵产物为蚯蚓养殖饲料，调节养殖温度为20～30℃和初始ph值为6～8，养殖若干时间，以养殖密度、ph值和温度为自变量，以蚯蚓日增重倍数为响应值，利用响应面法优化后确定最佳养殖条件。
上述方案中，所述最佳养殖技术条件为：养殖密度18.4条/dm3、初始ph值7.2和养殖温度26.8℃。
上述方案中，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖器皿中预先放置500dm3新鲜湿润泥土。
上述方案中，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，发酵产物的干重分别为50g。
上述方案中，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖器皿保持湿度为60％。
上述方案中，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖时间为两周。
上述方案中，所述蚯蚓日增重倍数的计算公式如下：
上述方案中，所述养殖饲料的发酵条件：发酵温度为25.6℃，发酵ph值为7.7，发酵时间为3天。
上述方案中，所述养殖饲料的步骤中，热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的比例为1∶1∶1。
上述方案中，所述养殖饲料的步骤中，金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所述蚯蚓养殖技术的优化方法是响应面法，可使废弃物金针菇菌渣和醋渣获得资源化高效利用。
2.本发明获得蚯蚓养殖技术，用于饲养蚯蚓，发现蚯蚓日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和牛粪组蚯蚓日增重倍数，饲养效果优于金针菇菌渣直接饲养及牛粪饲养。
3.本发明获得的蚯蚓养殖技术，技术简单，适用于大规模养殖，并可以解决废弃物造成的环境污染问题。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明养殖密度与初始ph值对蚯蚓日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。
图2为本发明养殖密度与温度对蚯蚓日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。
图3为本发明初始ph值与温度对蚯蚓日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。
图4为本发明发酵产物养殖的蚯蚓(a)、牛粪养殖的蚯蚓(b)和未发酵产物养殖的蚯蚓(c)图。
图5为本发明蚯蚓体内sod、gsh酶活性活性和mda含量图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明所述蚯蚓养殖技术的优化方法，包括以下步骤：
养殖饲料发酵：将热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌以比例为1∶1∶1的混合菌液接种到金针菇菌渣和醋渣的混合原料上，所述金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合，在发酵温度为25.6℃，发酵ph值为7.7，发酵时间为3天的条件下发酵得到发酵产物作为蚯蚓的生长饲料；
蚯蚓养殖条件优化：将蚯蚓以养殖密度为16～24条/dm3投入预先放置500dm3新鲜湿润泥土的养殖器皿中，分别加入干重50g的所述发酵产物为蚯蚓养殖饲料，实验平行3次，保持湿度为60％，调节养殖温度为20～30℃和初始ph值为6～8，采用孔径小于0.5mm的纱布封住养殖器皿口，养殖2周，以养殖密度、ph值和温度为自变量，以蚯蚓日增重倍数为响应值，考察此养殖技术使用金针菇菌渣和醋渣发酵产物对蚯蚓日增重的影响，利用响应面法优化后确定最佳养殖条件。
根据本实施例，优选的，所述蚯蚓为大平2号蚯蚓。
一种蚯蚓养殖技术优化后的应用，所述技术用于蚯蚓的养殖。本发明金针菇菌渣和醋渣发酵产物用于养殖蚯蚓，采用响应面方法对其养殖技术进行优化。具体养殖饲料发酵、蚯蚓体内酶活性测定、蚯蚓营养的成分分析测定方法如下：
1.养殖饲料发酵，按照下述步骤进行：优选的，将7.5％的热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液接种到金针菇菌渣和醋渣原料上，所述金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合，在发酵温度25.6℃，ph值7.7的条件下发酵3天后得到生长饲料。
2.蚯蚓体内酶活性测定，按照下述步骤进行：
样品预处理:取5条蚯蚓浸泡在清水中清肠后用去离子水洗净，用滤纸吸干蚯蚓体表水分，将蚯蚓剖开，称取一定量的蚯蚓，加入蚯蚓重量10倍的生理盐水，匀浆，备用。
sod、gsh活性测定和mda含量测定：参照南京建生物工程研究所所提供的说明书进行测定。
3.蚯蚓营养的成分分析方法，按照下述步骤进行：
样品预处：取养殖后的蚯蚓浸泡在清水中清肠后用去离子水洗净，用滤纸吸干蚯蚓体表水分，于105℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛，4℃保存，备用。
蛋白质含量的测定：采用凯氏定氮法测定金针菇菌渣和醋渣中粗蛋白含量(gb5009.4—2016)。
脂肪含量的测定：采用索氏提取法测定样品中脂肪的含量(gb5009.6—2016)。
水分含量的测定：采用饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定方法测定样品中水分的含量(gb/t6435-2006)。
此养殖技术中各成分的作用：
金针菇菌渣和醋渣：为蚯蚓养殖的饲料。其含有蛋白质、脂肪、纤维素和蚯蚓生存所必须的元素c、n、h和p等物质，可以为蚯蚓提供生存所需的养分。
药品与试剂：
大平2号蚯蚓，由江苏步龙生物科技有限公司提供；sod试剂盒、gsh-px试剂盒和mda试剂盒，购自南京建生物工程研究所；碳酸氢钠、醋酸、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸和亚甲基蓝指示剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
统计方法：数据用sas6.12统计软件进行处理，结果用表示，用组间t-检验比较各实验组与对照组之间差异的显著性。*代表p＜0.05，表示该组与对照组比较差异显著。
实验方法：将大平2号蚯蚓以一定养殖密度投入预先放置500dm3新鲜湿润泥土的养殖器皿中，分别加入干重50g的发酵产物为蚯蚓饲料，实验平行3次，保持湿度为60％，调节一定的养殖温度和初始ph值，采用孔径小于0.5mm的纱布封住养殖器皿口，养殖2周，考察此养殖技术使用金针菇菌渣和醋渣发酵产物对蚯蚓日增重的影响。蚯蚓的养殖密度、养殖温度和初始ph值见实施例。
实施例1
养殖密度：16、20和24条/dm3；
养殖温度为20、25和30℃；
初始ph值为6、7和8。
饲料总质量为50g，保持湿度为60％，用孔径小于0.5mm的纱布封住养殖器皿口，养殖时间2周，养殖结束后取样，计算不同养殖饲料对蚯蚓日增重的影响(日增重倍数计算公式如下)，并记录，确定最优的养殖条件。
采用实验设计软件design-expert8.0.6.1对蚯蚓养殖条件进行优化，根据box-behnkendesign的中心组合试验设计模型的设计原理，设计了三因素三水平的响应面分析试验，以x1(养殖密度)、x2(ph值)、x3(温度)为自变量，以蚯蚓的日增重倍数为响应值(y)，试验方案及试验结果见表1，共17个试验点，可以分为两类：第一种为析因点，自变量取值在x1(养殖密度)、x2(ph值)、x3(温度)所构成的三维顶点，共有12个析因点；第二种为零点，是区域的中心点，在零点位置试验重复5次，用来估计试验误差。
表1为不同试验条件下所测定的蚯蚓日增重倍数，利用design-expert8.0.6软件对表中粗蛋白含量试验数据进行多元拟合。表2为不同试验条件下所测定的蚯蚓的日增重倍数，利用design-expert8.0.6软件对表中蚯蚓的日增重倍数试验数据进行多元拟合，表2为回归分析结果。从表2的分析结果可知，整体模型model的“prob>f”值为＜0.0001，表明该二次方程模型比较显著，模型的失拟项的p值为0.1473，大于0.05，说明模型选择合适，该模型的r2＝0.9592，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量(养殖密度、ph值和温度)与响应值(蚯蚓日增重倍数)之间线性关系显著，可以用于发酵产物养殖蚯蚓的条件筛选试验的理论预测。根据回归方程的各项方差分析结果发现蚯蚓的养殖密度和养殖温度对蚯蚓日增重倍数的影响显著(p温度>ph值；交叉项中的x1x2、x1x3具有显著性(p
y＝0.039-1.000e-003x1+3.750e-004x2+8.750e-004x3-1.750e-003x1x2+2.250e-003x1x3-5.000e-004x2x3-5.750e-003x12-8.000e-003x22-5.000e-003x32
表1box-behnken设计方案及响应值结果
表2回归方程各项的方差分析
图1为蚯蚓的养殖温度为25℃时，养殖密度和初始ph值对蚯蚓日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。由图1可以发现，蚯蚓的养殖密度和初始ph值存在显著性交互，固定蚯蚓的养殖温度，随着养殖密度和初始ph值的增加，蚯蚓的日增重倍数也逐步提高，当养殖密度和初始ph值分别达到20条/dm3和7时，蚯蚓的日增重倍数达到最大，为0.0359。
图2为蚯蚓养殖初始ph值为7时，养殖密度和温度对蚯蚓的日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。由图2可以发现，养殖密度和温度存在交互作用，当初始ph值固定时，养殖密度和温度的增大对粗蛋白含量的影响同样显著。
图3为蚯蚓的养殖密度为20条/dm3时，养殖温度和初始ph值对蚯蚓日增重倍数影响的等高线图(a)和响应面图(b)。由图3可以发现，当养殖温度和初始ph值增加时，蚯蚓的日增重倍数随之提高，当温度>26℃时，初始ph值>7时，蚯蚓日增重倍数有所下降，由方差分析的结果可知，养殖温度和初始ph值没有显著性(p>0.05)。
经过以上对回归模型响应面的三维立体图分析，可以看到，由于各因素对蚯蚓日增重倍数的影响大小不一，在求取最优条件时，响应面分析法能够综合考虑各因素对不同响应值的正向和负向影响，进行综合评价。由响应面预测模型得出的最佳养殖技术条件为：养殖密度18.4条/dm3，初始ph值7.2，养殖温度26.8℃，此时的蚯蚓日增重倍数为0.0396，以最佳养殖技术条件进行蚯蚓养殖实验，在此条件下，蚯蚓的日增重倍数为条件0.0387，与预测值0.0396接近。可见，该模型可用于预测养殖密度、初始ph值和养殖温度对蚯蚓日增重倍数的影响。
实施例2
将实施例1中得出的最佳养殖技术条件用于蚯蚓养殖实验：
本实施例2以大平2号蚯蚓为实验对象，将20条蚯蚓投入到养殖器皿中，以蚯蚓日增重倍数为考察指标，牛粪和未发酵原料养殖蚯蚓为对照，采用优化后的最佳养殖技术条件：养殖密度18条/dm3，初始ph值7.2，养殖温度26.8℃养殖蚯蚓，考察此养殖技术使用金针菇菌渣和醋渣发酵产物对蚯蚓日增重的影响，并测定蚯蚓体内sod、gsh活性测定和mda含量及其营养成分的分析。
研究发现，发酵饲料组蚯蚓日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和空白组蚯蚓日增重倍数(p＜0.05)，因此经过发酵后的金针菇菌渣和醋渣可用于饲养蚯蚓，并且效果优于金针菇菌渣直接饲养及牛粪饲养方法。
金针菇菌渣和醋渣发酵产物组蚯蚓日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数(p＜0.01)和牛粪饲养组蚯蚓日增重倍数(p＜0.05)，其蚯蚓的日增重倍数比未发酵饲料和牛粪饲养蚯蚓分别提高了69.74％和23.25％。其发酵饲料组蚯蚓日增重倍数为0.0387±0.0040，未发酵组蚯蚓日增重倍数为0.0228±0.0020，牛粪组蚯蚓日增重倍数为0.0314±0.0019。
如图4所示，发酵产物养殖的蚯蚓(a)、牛粪养殖的蚯蚓(b)和未发酵产物养殖的蚯蚓(c)图，利用优化后的养殖技术，发酵产物饲养的蚯蚓个体较大、颜色深红以及环带明显；牛粪养殖的蚯蚓相对于发酵产物养殖的蚯蚓个体较小，个体颜色及环带状况较发酵产物组无明显差异；而未发酵原料养殖的蚯蚓个体偏小，颜色偏黑，可能由于营养不良所致。可见，此养殖技术可使用发酵后金针菇菌渣和醋渣饲养蚯蚓。
如图5所示，与对照组相比，发酵产物组的蚯蚓体内sod和gsh活性显著提高(p＜0.05)，未发酵产物组蚯蚓体内sod和gsh活性显著降低(p＜0.05)，与未发酵原料相比，发酵产物可使得蚯蚓体内sod和gsh酶活性提高20.93％和16.89％；未发酵组蚯蚓体内mda含量显著高于对照组(p＜0.05)，发酵产物组蚯蚓体内mda含量显著低于对照组(p＜0.05)，未发酵原料相比，发酵产物可是蚯蚓体内mda含量降低19.98％。可见，此养殖技术使用发酵后金针菇菌渣和醋渣饲养蚯蚓可提高蚯蚓体内的代谢功能和抗氧化能力，从而提高蚯蚓的产量和品质。
对蚯蚓粉进行营养成分的分析发现蚯蚓粉中的粗蛋白含量高达57.52％，高于市场常用的蛋白饲料豆饼的38.37％和鱼粉的55.24％，且粗脂肪含量为10.93％，水分含量为9.56％，满足国标gb/t19164-2003中鱼粉二级品的标准。可见，此技术养殖后的蚯蚓可用作蛋白饲料。
本发明通过响应面分析法发现使用发酵后金针菇菌渣和醋渣养殖蚯蚓的最佳养殖技术条件为:养殖密度18.4条/dm3、初始ph值7.2和养殖温度26.8℃，该条件下，蚯蚓的日增重倍数为0.0387；
采用上述最佳养殖技术条件饲养蚯蚓，发现其日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和牛粪组蚯蚓日增重倍数，饲养效果优于金针菇菌渣直接饲养及牛粪饲养方法。可见，此养殖技术可使用发酵后金针菇菌渣和醋渣饲养蚯蚓；
酶活性分析：此养殖技术使用发酵后的金针菇菌渣和醋渣养殖蚯蚓可以显著提高蚯蚓体内sod和gsh酶活性，降低蚯蚓体内mda含量；
营养成分分析：蚯蚓粉中的粗蛋白含量高达57.52％，粗脂肪含量为10.93％，水分含量为9.56％，符合gb/t19164-2003中鱼粉二级品的标准，可用作动物蛋白饲料。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
养殖饲料发酵：将热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的混合菌液接种到金针菇菌渣和醋渣的混合原料上，在发酵条件下发酵后得到发酵产物；
蚯蚓养殖条件优化：将蚯蚓以养殖密度为16～24条/dm3投入预先放置新鲜湿润泥土的养殖器皿中，分别加入所述发酵产物为蚯蚓养殖饲料，调节养殖温度为20～30℃和初始ph值为6～8，养殖若干时间，以养殖密度、ph值和温度为自变量，以蚯蚓日增重倍数为响应值，利用响应面法优化后确定最佳养殖条件。
2.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述最佳养殖技术条件为：养殖密度18.4条/dm3、初始ph值7.2和养殖温度26.8℃。
3.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖器皿中预先放置500dm3新鲜湿润泥土。
4.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，发酵产物的干重分别为50g。
5.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖器皿中发酵产物保持湿度为60％。
6.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述蚯蚓养殖条件优化步骤中，养殖时间为两周。
7.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述蚯蚓日增重倍数的计算公式如下：
8.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述养殖饲料的发酵条件：发酵温度为25.6℃，发酵ph值为7.7，发酵时间为3天。
9.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述养殖饲料的步骤中，热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的比例为1∶1∶1。
10.根据权利要求1所述的蚯蚓养殖技术的优化方法，其特征在于，所述养殖饲料的步骤中，金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合。
技术总结
本发明提供一种蚯蚓养殖技术的优化方法，包括以下步骤：养殖饲料发酵：将热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的混合菌液接种到金针菇菌渣和醋渣的混合原料上，在发酵条件下发酵后得到发酵产物；蚯蚓养殖条件优化：将蚯蚓以养殖密度为16～24条/dm3投入预先放置新鲜湿润泥土的养殖器皿中，分别加入所述发酵产物为蚯蚓养殖饲料，调节养殖温度为20～30℃和初始pH值为6～8，养殖若干时间，利用响应面法优化后确定最佳养殖条件。本发明最佳养殖技术条件为养殖密度18.4条/dm3、初始pH值7.2和养殖温度26.8℃，此养殖技术的饲养效果优于金针菇菌渣直接饲养及牛粪饲养方法，并可显著提高蚯蚓体内SOD和GSH酶活性，降低蚯蚓体内MDA含量。
技术研发人员：吴向阳;冯伟伟;费凡;茆广华;丁阳阳;赵婷;仰榴青
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2019.09.04
技术公布日：2019.12.20
