新疆农业科学2017，54(8)：1489—1495Sciences XinjiangAgricultural doi：10．6048／j．issn．1001-4330．2017．08．015一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生菌的鉴定及其生物学特性研究努尔孜亚·亚力买买提，魏鹏，贾培松，罗影，郝敬黏，贾文捷(农_4k部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室／新疆农业科学院植物保护研究所，鸟鲁禾齐830091)摘要：【目的】制作巴尔喀什蘑菇培养料生产过程中，常发现一种腐生菌引起的病害，表现为棉籽壳发酵料发酵温度持续偏低，料面湿滑。研究该病害的病原和生物学特性，为该病害的有效控制提供依据。【方法】分离得到病原菌，观察形态特征和分析rDNA—ITS序列。【结果】该病原菌为粉红菌寄生菌(Hypomycesrosellus)的分生孢子阶段Cladobotryum膦菌寄生所致巴尔喀什蘑菇粉红菌病。该病原菌菌丝体最佳生长条件为5．5偏酸性生长。葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，光照对菌丝体生长有一定抑制作用。20℃，属低温菌，pH【结论】在食用菌生产过程中前期严格控制温度条件，做好二次发酵，加强通风和环境卫生管理有助于预防巴尔喀什蘑菇红菌病害发生。
关键词：巴尔喀什蘑菇；发酵料；腐生菌鉴定；粉红菌；生物学特性中图分类号：$188 文献标识码：A文章编号：1001—4330(2017)08—1489—07内中心最高温度仅60。C。将培养料置于栽培床 O 引言上，料面湿滑有一层水渍，并伴有氨气状腥臭味。【研究意义】巴尔喀什蘑菇是新疆特有的野 巴尔喀什蘑菇与双孢菇菌种在培养料表面正常萌 生食用菌品种，主要生长在中亚地区内陆湖泊附发，但前期萌发菌丝向培养料内走菌缓慢或停滞 近【lJ，我国新疆部分地区有分布悼j，目前还未能 生长，菌丝细弱，到生长后期料温升高蘑菇菌丝发 大规模人工栽培。【前人研究进展】培养草腐菌育能基本恢复正常。研究该病害的病原和生物学 巴尔喀什蘑菇、双孢菇等栽培食用菌常常受到病特性。【拟解决的关键问题】研究该病害的病原 害的侵扰，大多数致病真菌是霉菌类，具丝状菌菌种类与其发生危害程度，分析病原学及其生物 丝。这些病原真菌除腐生外，还具有不同的寄生性质，为科学防治该病害提供理论依据。 性，多喜高温、高湿和酸性环境，其中疣孢霉引起1材料与方法 的褐腐病、轮枝霉引起的干泡病、轮指孢霉引起的 软腐病、头孢霉引起的褶霉病、镰孢霉引起的猝倒1．1 材料 病等为当地多见常发病害”J。
严重影响栽培的 1．1．1供试茵株 食用菌产量和品质。【本研究切人点】2014年底，病原菌分离自巴尔喀什蘑菇培养料棉籽壳。 在阜康市职业技术学校双孢菇生产实验基地，驯1．1．2培养基 化巴尔喀什蘑菇试验时，发生了一种病害，该病害马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g，葡萄糖20000 的症状表现为，棉籽壳培养料发酵时料温较低，料g，琼脂粉20g，水1 mL。通常称PDA培养 收稿日期(Received)：2017一05—10 基金项目：国家自然科学基金项目；国家现代农业产业技术体系项目(CARS一24) 作者简介：努尔孜亚·亚力买买提(1977一)，女，新疆伊犁人，助理研究员，研究方向为栽培食用菌种质资源保藏与病虫害防控，(E—mail)823037554@qq．corn 万方数据 1490新疆农业科学54卷6中采用邻近归并法 基。分析‘71。同时在软件MEGA000次boo雠ap验证构建马铃薯加富培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 (neighborjoining)经1000 g，琼脂20g，蛋白胨8g，水l mL。也称PDA系统发育树婶J。 加富培养基。
1．2．3病原茵生物学特性基础培养基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，KH2 1．2．3．1温度10．5000d后，用经灭 P04g，MgS04g，琼脂20g，蒸馏水1将病原菌在PDA平板上培养5 mL。菌的直径5mm的打孔器打取菌落圆片，将菌落基础加富培养基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，圆片接种在直径9em的PDA平板上，置于不同10温度下恒温培养。温度设置为5、10、15、20、25、g，VBlmg，琼脂20g， KH2P041g，MgS040．5000 蒸馏水1 mL。30和35。C等7个梯度，培养4d后采用划“十” 1．1．3杀茵剂字法测量菌落直径，计算菌丝体生长速度，每个处50％咪酰胺锰盐可湿性粉剂(上海生农生化 理4次重复。 制品有限公司)、50％苯菌灵可湿性粉剂(台湾兴1．2．3．2pH值moL／Lmol／L 农中国有限公司)、70％甲基托布津可湿性粉剂在无菌条件下用1NaOH和1 (江苏龙灯化学有限公司)、75％百菌清可湿性粉 剂(江苏科宁利民化工有限公司)。 1．2方法2．3．1。 1．2．1病原茵的分离纯化1．2．3．3碳源首先，在无菌条件下，用无菌水轻轻冲洗发病以马铃薯加富培养基与基础培养基为对照， 巴尔喀什蘑菇棉籽壳培养料3遍后，用灭过菌的 分别用蔗糖、麦芽糖、淀粉来代替葡萄糖作为处理 滤纸吸干棉籽壳表面水分，将棉籽壳接种到PDA 组。
方法同1．2．3．1。 培养基上，贴上封口膜后倒置于25℃恒温箱中黑 1．2．3．4氮源 暗培养，待长出菌落后进行单孢分离纯化，获得纯以马铃薯加富培养基与基础培养基为对照， 培养物，并进行菌种删一1保藏Hj。分别用酵母粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠来代替蛋白 1．2．2病茵rDNAITS序列测定胨作为处理组。方法同1．2．3．1。1．2．3．5光照(1)总DNA的提取：采用CTAB法提取病原 菌菌丝体的总DNA。将1．4．1制得的菌落圆片接种在PDA平板(2)rDNAITS序列测定和分析：ITS序列扩上，置于25。C光照培养箱中，分别设完全光照和 增选用真菌通用引物¨o。完全黑暗两个处理，培养4d后采用划“十”字法测量菌落直径，计算菌落生长速度，每个处理设4PCR反应体系(25斗L)：17．7斗L双蒸DD无10X 菌水，2斗L buffer，2斗LdNTP，引物ITSl和次重复。Taq酶。 1．2．4致病性测定 ITS4各1斗L，1斗L模板DNA，0．3卜L PCR反应条件：94℃预变性5rain，然后94℃变性 平板对峙培养：在PDA平板培养基表面一端 45s，550C退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循相隔5em距离先接种双孢菇菌株，3d后菌株萌 环，最后72cc延伸10min。
PCR扩增产物经1％发定植后，接目标菌株fbj一1。在25恒温箱中黑 琼脂糖凝胶电泳检测后送交生工生物工程(上 暗培养，观察菌落之间有无抑菌带以及抑菌带的 海)股份有限公司进行测序。测序结果在Gen—宽度和拮抗方向等。1．2．5杀菌剂抑茵性测定 Bank(NCBI，ht印：／／www．ncbi)对比，经GenBank 中Blast后，下载与本序列最相近的序列以及其他 以PDA为培养基定量分装于三角烧瓶内灭v7．037b菌”待培养基冷却至50。C左右时分别加入咪酰胺 相关真菌序列共6条(表1)，经MAFFF 进行序列比对及手工校正后，保存为FASTA格锰盐、苯菌灵、甲基托布津和百菌清可湿性粉剂，3．2进行贝叶斯推理法(BI)各药剂浓度稀释1000倍，摇匀后倒人培养皿。 式Mj。使用MrBayes 万方数据 8期努尔孜亚·亚力买买提等：一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生茵的鉴定及其生物学特性研究1491 待凝固后分别接直径为5姗的粉孢茵菌块。以 ～5 cm，菌落粉红色，表面蜡质，背面变黄(图 不加杀菌剂的培养基作空白对照。每一处理重复1A)。菌丝发达，纤细，具有隔膜(图1B)。
分生 4次。接种5d后采用十字交叉法测量菌落直 孢子梗枝状分枝，芽殖单生产孢(图1C)。分生孢 径，计算病原菌菌丝生长抑制率。子单生或成聚生，分生孢子卵圆形，单胞或双胞， 2结果与分析见有性世代出现。形态鉴定该病菌为葡枝霉属 2．1o。病菌培养特性及形态特征Cladobotryum嗍真菌属粉红菌pd后直径4病菌在PDA上生长迅速，培养3(A)病场f菌苗辫形念；(B)筒丝体形念(10xlo)；(c)孢子桠。』分小孢子(10x16)；(D)分小弛子(10X40)onandeonidia(10x16)；D：conidias(10x40)A：ColonyPDA；Brtrycelium(10X10)；c：Conidiophores图1 粉红菌寄生的菌落和形态特征andofmorphologyCladobotryumsp．Fig．1ColonyIfIs序列和 2．2病原菌rDNA生Hypomyces基于ITS一5．8SrDNA序列，扩增和凝胶电泳 检测，获得大小约600bp的片段。经测序测试，通过系统发育分析，供试菌株序列与Clado—odoratus在同一botryummycophilum和Hypomyces 确定供试菌株fbj一1(EC5DKXBJ016)的rDNArtoe3粉红葡枝霉。
图2 ITS片段长度为591分支上属Cladobotryumbp。经与GenBank中相关基 因序列进行同源性比对，菌株啊一l与金黄菌寄表1基因序列同源性比对!璺垒!皇!塑堕垒!!曼!竺塑里坚!墅璺塾竺2坠燮竺坐壁型竺菌株类型相似率GenBank登录号寄主No．HostDescriptionIdent(％) C,enBankAccession 万方数据1492新疆农业科学54卷P———————叫0．5标尺0．5为进化距离scale0．5is distanceevolutionary图2基于rDNAITS序列构建的啊一1系统发育树2treebasedconstructedonrDNAITSfbj一1sequenceFigphylogenefic 2．3病菌生物学特性其中以葡萄糖为最好，其次为蔗糖和淀粉，对麦芽 2．3．1温度对菌丝体生长的影响糖利用较差。研究表明，该菌在不同的温度下生长速度存2．3．4氮源对茵丝体生长的影响 在显著差异。该菌在5—35℃内均可生长，最适研究表明，病菌对除尿素以外的其他4种氮 温度为20％。当温度达到40％时菌丝体停止生源均可利用，以蛋白胨效果最佳，酵母粉和硫酸铵 长。
次之，硝酸钠较差，尿素几乎不利用。 2．3．2pH值对菌丝体生长的影响2．4致病性测定研究表明，该菌在pH4．5—10的范围内均可 经对峙测定，发现靠近蘑菇菌落处，双孢蘑菇 生长，最适pH为5．5。当pH达到10以后，菌丝菌丝变白浓密，似乎形成拮抗线。显微观察显示 体停止生长。病菌菌丝体在酸性条件下生长良两者菌丝问未发现相互缠绕的绞杀现象，呈现出 好。菌丝间的交叉重叠。二者是对营养和空间的竞争 2．3．3碳源对茵丝体生长的影响关系属于竞争性杂菌。图3研究表明，该病菌对供试4种碳源均能利用，A：双孢菇菌丝；B：病原菌菌丝A：Agaric,,,bisporm；B：Cladobotryum图3 双孢菇菌落与病原菌茵落对峙培养形态Stand eachother withandFig．3facingcolonypathogenA弘啦螂bisporus 2．5杀菌剂对病原菌粉孢菌菌丝生长的影响37％以上。百菌清抑菌效果不明显仅有4种杀菌剂对病原菌菌丝均有一定的抑制作 16．19％。差异性分析发现，不同杀菌剂对病原菌 用，其中咪酰胺锰盐抑菌效果最好达73．73％，其菌丝生长的抑制作用呈现显著性差异。
次是苯菌灵和甲基托布津，抑菌成果均亦达到 万方数据 8期努尔孜亚·亚力买买提等：一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生茵的鉴定及其生物学特性研究1493表2 4种杀菌剂下病原菌菌丝生长变化Table2Effectsof4ontheofofbacteriafungicidesgrowthmyceliumpathogenic堕苎皇堡菌丝生长抑制率差异显著性杀菌剂名称IIImIV(％)0．050．01列分析可以判断是属于葡枝霉菌的无性型阶段粉 3 讨论rtoe$。该病原菌的菌丝体生长孢菌Cladobotryum巴尔喀什蘑菇是中亚地区包括我国新疆内陆5．5属低温阶段最适生长条件是，温度20。C，pH 湖畔红柳和芦苇等腐殖层下生长的一类大型食用菌。最适碳源葡萄糖，最适氮源蛋白胨。防腐保 菌，通常在每年的春秋两季形成硕大的子实体。鲜剂咪酰胺锰盐防效达73．63％并且残留低，蘑 子实体通常埋生在地表下30～50cm，很少暴露 菇栽培期间对该病害的防控应在蘑菇生产过程中 地面…，目前该菌尚不能人工栽培。实验以棉籽前期严格控制温度湿度，净化环境条件，做好二次 壳为主要栽培基质培养巴尔喀什蘑菇，采用培养发酵工作，同时加强通风和环境卫生管理有助于 双孢菇的开放式栽培方式。
培养料通过自然发预防该病害发生。 酵，改变内部营养成分和消除杂菌¨0。¨j。由于环 参考文献(References) 境和人为因素的影响形成二次污染。竞争性病害BMIXAIIICKHl7Ibalchaschensis 葡枝霉病在培养料表面可形成圆形的浓密白色粉IILMMIIM／-I飞OH AgaricusSamget Nam 印． nov， CPEJI,AM 状菌丝区，偶尔侵染床面上残留子实体，形成红色IICP0l(瑚C伍【oHOⅢEHM且．”6Hon031田recKa且Celm卫2|。 或黄色的病菇，最终变成黑色或褐色，腐烂【1Me3ttTacxa_．28(3)：51—54． 该病分布于有机质丰富的有机残体中，在温度20 [2]赵震宇，陈梦．新疆野生蘑菇[M]．北京，中国林业出版社， ～30℃，菇房湿度90％以上时易发病，可为害茶 2013：1—50ZHAO 树菇、滑子菇、杏鲍菇多种食用菌¨引，已在欧洲、Zheng—yu，CHENChinaForestryPublishingHouse：1—50． 美洲和亚洲等地区都有报道，是一种世界性病害rooms[M]。
Beijing(inChinese) 应引起双孢菇生产部门高度重视。药剂防治栽培pest 食用菌竞争性杂菌，先了解感染蘑菇的病原菌对anddiseasecontrol—aeolourhandbook．Mycologia． 它的的敏感性非常重要，选择高效低毒低残留的[4]方中达．植病研究方法[M]，第3版，中国农业出版社， 杀菌剂用于控制食用菌竞争性杂菌¨4|。咪酰胺1998．FANGOnPlantPathology 锰盐、苯菌灵和甲基托布津对防控粉孢菌有较好Zhong～da．(1998)．MedⅫlologyResearch(3rdAgriculturePress： 的防效，其中防腐保鲜剂咪酰胺锰盐防效达EeL)[M]．Beijing：China122—145(inChinese) 73．63％并且残留低可以推荐使用。百菌清对该 病原菌防治效果较低不敏感。物理防治有效的蒸of ofYoung，J．(2012)．CharacterizationspeciescladobotryumwhichcauseedibleinKore-cobwebdiseasein mushrooms 汽蒸煮是目前防治该病原菌最好的方法，目前双grown 孢菇栽培场所推广的二次发酵和三次发酵技术可a．Mycobiology，40(3)：189—194．Se- 以防控该病害发生。
multiplesoftwareversion inquenccalignment 7：improvementsperform-8neeand 4 结论usability．Molecular772—780．分离得到的病原菌通过对峙实验表明属于竞[7]Ronquist，F．andS．Klopfstein，ettotal—ev— 争性杂茵。通过组织形态学观察与rDNAITS序from：A 万方数据 1494新疆农业科学54卷idence to withtothe radi—WANGapproachdatingfossils，appliedearlyonDifferentsllbs扭al∞CultureofationoftheStudyAgaricusBispoms[J]．Hymenoptem．跏te删如B／o／ogy，61(6)：973—999． [8]张琪辉王威李成欢温志强．斑玉蕈蛛网病的病原菌及其生(inChinese)物学特性[J]．菌物学报，2015，34(3)：350-356．[12]刘树才，刘国宇．双孢菇标准化栽培及培养料发酵管理技ZHANG WANGa1．Wei，LI术[J]．蔬菜，2013，(3)：19—21．Qi—huiCheng—huan，etcharacteristicsof aurantiusLIUcultivation(2015)．Biological Hypomycespar-Shu—cai，LIUGuo—yu．(2013)．StandardizedasiticonofandfermentationofAgaricusbisporusmanagementtechnologyHypsizygusn3allllol℃us[J]．Mycosystema，34(3)：350—356．(inChinese)cultureChinese) [9]魏景超．真菌鉴定手册[M]．上海：上海科学技术出版社．[13]宋金娣．食用菌病虫图谱及防治[M]．南京：江苏科学技1979．术出版社，2011．WEISONG1)．EdibleDiseasesandInsectPestsJing—chao．(1979)．Fungalldent乒tcationManual[M]． Jin—di．(201 FungusandScienceandTechnol—andAtlasShanghai：ScienceTechnologyPress．(inChinese)Control[M]．Nanjing：JiangsuPress．(inChinese) [10]弗莱彻与盖泽，蘑菇病虫害防控[M]．北京，中国林业出 ogy版丰|．2015．[14]边镦阿．食川菌病W搭别‘j防托[M]．郑州：-It坊!农比_『|；版PestandDiseaseCoraml }I：，2016．Fletcher，Gaze(2015)．MushroomBIANDiseasesForestryPublishingHouse．(inChinese) Yin—bing(2016)．Ed／bleFungus ldent乒cation[M]．Beijing：ChinaandPlainsFarmersPress． [11]王芳，张玉萍，鹿有贵，等．不同基质栽培双孢菇研究[J]．Control[M]．Zhengzhou：Central135一l137．山西农业科学，2016，(8)：l(inChinese) 万方数据 8期努尔孜亚·亚力买买提等：一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生茵的鉴定及其生物学特性研究1495CharacteristicsofBiologicalCladobotryllmsp．parasiticonFermentMaterialofbalchaschensisAgaricusNurziyaYalimaimaiti，WEIPeng，JIAPei—song，LUOYing，HAOJing—zhe，JIAWen—jieVermininChinaNorth—western(研LaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCorpOasis，InstitutePlanth／矗nistryof Protection，ofAgriculture，P．R．China／ResearchXinji口，lg ofAgriculture830091，China)AcademySciences，Urmnqinewdiseaseis foundinthebalchas-Abstract：【Objective】ThealwaysprocessproductionofAgaricas chensisresultsincontinuouslowfermentation andwetsmface．Thiscultivation，whichtemperatureproject aimsto theandcharacteristicsofthediseaseinorderto basisformorecffec-studypathogenbiologicalprovide tiveitsrDNAtoobservationandobtaincontr01．【Method]Throughmorphologicalsequenceanalysis pathogenicWasdeterminedtobethe onthebi— bacteria．【Result】ThepathogenicfungusCladobotryum．sp．ThroughstudycharacteristicsoftheWasfoundthatitsbestconditionswas ologicalpathogenicbacteria，itmyceliumgrowth 20。
ClowwasitscarbonWastemperaturebacteria，acidicpH5．5growth，glucose SOUrCe，peptonenitrogenhadacertaineffectonandcontrol source，andlightinhibitory mycelialgrowth．【Conclusion】Theprevention ofthediseaseshouldbe controlledtheconditionintheoftheofstrictly by temperatureearlystage productionthesameventi— edibletwofermentationworkshouldbecarriedout．Atthethefungi，andtime，strengthening lationandenvironmentalsanitation winthedisease．managementhelppreventofKeybalchaschensis；fermentmaterial；identificationsaprophyticwords：Agaricuscharacteristics ryumsp．；biologicalNaturalScienceFoundationofChinaModembybyAgriculturalIndustryTechnology Supportedby：SupportedChina；SupportedSys— tern(CARS一24)．author：JIA CorrespondingWen-jie(1969一)，(E—mail)1612367472@qq．com 万方数据
