1.本发明涉及三叶青种植技术领域，更具体地说是涉及一种提升三叶青块根中黄酮含量室内光照控制方法。
背景技术：
2.三叶青(tetrastigma hemsleyanum diels et gilg)为葡萄科(vitacvae)崖爬藤属(tetrastigma)植物，为民间常用中草药，又称金线吊葫芦、三叶扁藤等。三叶青块根(生长期3
‑
4年)，具有抗肿瘤、抗病毒、保护肝脏、抗炎镇痛等作用。现代医学研究表明：三叶青含有丰富的三叶青黄酮、多糖、山奈酚成分。研究表明三叶青黄酮、β－谷甾醇、多糖、山奈酚等能有效抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，具良好的抗肿瘤作用，且无毒副作用。对绝大多数的原发癌、转移癌等均具有很好的治疗作用，对肿瘤化疗带来的种种不良反应，如食欲低下、呕吐、恶心、头发脱落以及白细胞减少等都有明显的改善作用，对晚期患者有缓解疼痛作用，它还能有效地提高人体的免疫功能；而且三叶青具广谱(适用各种实体瘤和非实体瘤患者服用)，高效(能迅速改善癌性发热、疼痛、胸腹水、白细胞下降、厌食、乏力等恶病质症状，起效快，临床总有效率高)，无毒(为纯天然植物提取物，经试验无任何毒副作用)，无耐药性(能够全方位、多环节、多靶点的抑制肿瘤，与化疗药物的细胞毒作用完全不同，临床运用没有抗药情况出现)。
3.三叶青主要活性成分黄酮类物质，主要包括原花青素b1、儿茶素、原花青素b2、芦丁、异槲皮苷、山奈酚
‑3‑
‑
芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷等，但不同产地环境的三叶青黄酮组成存在显著差别。长期以来，三叶青药材一直依赖野生资源，非再生性采挖一方面导致野生三叶青资源蕴藏量急剧下降，许多传统产区无药可采；另一方面不同产地野生三叶青有效成分变异明显高于人工栽培，影响三叶青质量。因此，加强三叶青仿野生栽培技术研究，是三叶青可持续发展的迫切需求和有效途径。
4.三叶青适宜生长于0.7左右郁闭度的山谷、灌木丛间等腐殖质较高的林下，在阳光直射的地方偶有生长，但生长不良。随着第一批仿野生栽培三叶青进入采收期，产量低、品质差异大甚至不结块根的现象逐渐引起林农及研究人员的关注。以光照、温度、水分等环境因子对三叶青生长发育影响研究为基础的精准化栽培技术成为目前三叶青亟需解决难点。道地药材是长期适应环境胁迫的产物，林下光环境因为林冠的存在，光的组成和变化比温室和苗圃地中更为复杂，使得光因子成为影响林下三叶青药材道地性的重要因子之一。建立精准光控技术，既有助于提升林下三叶青仿野生栽培技术，也有助于提升室内栽培的质量。
5.因此，如何提供一种提升三叶青块根中黄酮含量，保证块根产量的光照控制方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明提供了一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，
通过控制光照强度和光照时间，提高了块根中黄酮的含量。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，对三叶青单株进行1500
‑
2000lux白光+0.02
‑
0.03μw/cm2紫外光的光照组合照射；其中，所述三叶青单株为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得。
9.植物通过调控苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，pal)和查尔酮合酶(chalcone synthase，chs)等系列酶基因的表达，调控黄酮的合成和积累作出应答，而这些酶的活性及其分子合成水平又受光照、温度、水分等环境因素的影响。pal和chs是黄酮合成代谢途径中两个关键酶。pal是连接初级代谢和苯丙烷类代谢，催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶和限速酶，分子量220
‑
330kda，是一种酸性蛋白。pal是目前光胁迫对黄酮积累影响研究最多的一个酶。总黄酮的含量变化趋势与pal酶活性的变化趋势基本一致，且略滞后于酶活性的变化。光胁迫首先诱导pal酶的表达实现黄酮合成代谢通路的下游支路的调整。chs是类黄酮物质生物合成途径的第一个限速酶,分子质量为42～45kda，催化丙二酰基辅酶a的3个乙酸基和对羟苯丙烯酰辅酶的一个乙酸基的缩合，产生查尔酮。光强和光质对植物体内酶活性及基因表达产生影响，随光强增大活性升高。pal活性主要受紫外光调节，chs基因表达产生mrna受蓝光、紫外光的调节，两者对光的响应较其它酶显著。迄今为止，相关领域研究人员已对拟南芥、人参、苦荞等多种植物光胁迫黄酮应答规律进行了研究，光强对不同植物黄酮类化合物的影响不同，随着光强增大多数植物黄酮类化合物含量增加。光质影响一般是短波段光可促进黄酮物质的积累，特别是紫外光uv
‑
b(280
‑
315nm)可显著影响黄酮类化合物(被称为uv
‑
b滤除器)积累。
10.作为本发明优选的技术方案，白光的辐照时间为8点～16点；紫外光的辐照时间为11点～13点；连续照射45天。
具体实施方式：
11.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.本发明实施例公开了一种提升三叶青中黄酮含量的方法，具体方案如下：
13.实施例1三叶青的叶、茎及块根黄酮白光胁迫下生物量及黄酮积累规律；
14.单白光照射实验：采用栽培架，每层放置50株三叶青(2年生，为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得，藤长30公分左右，叶片颜色较一致，在每层培养架中下部用铁丝网搭一平台，并将三叶青藤铺在铁丝网上，便于均匀接受光照射)，安装白光光源(40w白光荧光灯管，经紫外辐照仪测定无紫外光强度)，用光照强度测定仪测定光强(分别测定栽培架四个角及中心点的光照强度，并取平均值作为本层的光照强度值)，调节开启灯管数目及三叶青与灯管的距离，使光照强度达到设定值，每天处理8h，连续照射45天，每个处理三个重复。每隔15天，选取5株，采集叶、茎、根及块根待测。
15.对四个白光室内实验组：1000
‑
1500lux(实测值为1223lux)，1500
‑
2000lux(实测值为1689lux)，2500
‑
3000lux(实测值为2607lux)的光照实验的三叶青，每个组分别取三
盆，植株解析为叶、茎、根、块根，分别称量四个部分的鲜重及干重。
16.实验结果见表1；
17.表1
[0018][0019]
由表1可知：1000
‑
1500lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为12.29g，茎鲜重为12.05g，根鲜重为2.42g，块根鲜重6.61g，单株总鲜重为31.16g；1500
‑
2000lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为23.48g，茎鲜重为14.86g，根鲜重为7.13g，块根鲜重4.30g，单株总鲜重为49.76g。2500
‑
3000lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为15.24g，茎鲜重为11.01g，根鲜重为5.22g，块根鲜重2.91g，单株总鲜重为34.37g。1500
‑
2000lux实验组，三叶青叶片、茎及根的鲜重均为三个组别里面最高的，但是块茎总重却低于1000
‑
1500lux组别，其原因为高光照强度促进了光合作用，促进了地上植株的生长，地下块茎的营养向上输送，导致块茎生长减缓。对叶片大小及叶面积进行了量测。随着光照强度增加，三叶青的叶片长度是增加的趋势，而宽度却呈减小的趋势。1000
‑
1500lux(实测值为1223lux)组别平均叶面积最大，其次是2500
‑
3000lux组，最小的为1500
‑
2000lux组别。
[0020]
对不同的光照下，单株中槲皮素，槲皮苷，异槲皮苷，芦丁，荭草苷及异荭草苷六种黄酮的总含量进行测定，结果见表2；以1500
‑
2000lux组别的组别最高，其中叶中平均含量为0.5035mg/g，茎中平均含量为0.2723mg/g，根中平均含量为0.0884mg/g，块根中平均含量为0.0638mg/g。
[0021]
表2
[0022][0023][0024]
实施例2三叶青叶、茎及块根pal、chs应答uv
‑
b胁迫规律；
[0025]
白光+uv
‑
b复合照射实验：采用栽培架，每层放置50株三叶青(2年生，为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得，藤长30公分左右，叶片颜色较一致，在每层培养架中下部用铁丝网搭一平台，并将三叶青藤铺在铁丝网上，便于均匀接受光照射)，安装实验光源(40w白光荧光灯管；40w紫光荧光灯管，发射光谱区域为300
‑
320nm)，用光照强度测定仪和紫外辐照仪测定光强(分别测定栽培架四个角及中心点的光照强度，并取平均值作为本层的强度值)，调节白光开启灯管数目及铁丝网与灯管的距离，使辐照强度达到设定值。仿照野外太阳光的规律，每天白光处理8h，紫外光辐照2h，连续
照射45天。每隔15天，选取5株，采集叶、茎、根及地下块根待测。
[0026]
具体为：
[0027]
每组50株进行紫外光胁迫实验。根据林下紫外线强度特点，采用1500
‑
2000lux的白光，结合0.01μw/cm2，0.02μw/cm2，0.05μw/cm2，0.1μw/cm2的紫外光为实验组，以1500
‑
2000lux的白光的为空白实验。每天紫外光辐照时间是11点
‑
13点，白光辐照时间为8点
‑
16点。辐照45天后每个实验组取样3盆，植株分解为叶、嫩茎、老茎、主根、须根、块根，测定苯丙氨酸解氨酶(pal)、查耳酮合成酶(chs)活性。结果显示叶和嫩茎中pal活性以0.1μw/cm2组别最强，分别为23.63u/g/min及16.58u/g/min，说明高紫外辐照，新生组织中pal活性强，以促进植株抵御外界逆境的能力。而老茎则以空白实验中pal活性最高，说明老茎受pal活性受逆境的影响较小。主根、须根及块根中pal活性均显著高于空白，其中0.02μw/cm2实验组中主根pal活性更是高达198.91u/g/min，0.01μw/cm2组中块根pal活性高达103.17u/g/min。老茎的chs活性也以空白最高，说明老茎受紫外光辐照影响较小。0.02μw/cm2实验组中叶chs活性最高为1.36iu/g，嫩茎中以空白最高，其次是0.01μw/cm2实验组。chs活性最强的为0.02μw/cm2实验组中的块根。
[0028]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0029]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
1.本发明涉及三叶青种植技术领域，更具体地说是涉及一种提升三叶青块根中黄酮含量室内光照控制方法。
背景技术：
2.三叶青(tetrastigma hemsleyanum diels et gilg)为葡萄科(vitacvae)崖爬藤属(tetrastigma)植物，为民间常用中草药，又称金线吊葫芦、三叶扁藤等。三叶青块根(生长期3
‑
4年)，具有抗肿瘤、抗病毒、保护肝脏、抗炎镇痛等作用。现代医学研究表明：三叶青含有丰富的三叶青黄酮、多糖、山奈酚成分。研究表明三叶青黄酮、β－谷甾醇、多糖、山奈酚等能有效抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，具良好的抗肿瘤作用，且无毒副作用。对绝大多数的原发癌、转移癌等均具有很好的治疗作用，对肿瘤化疗带来的种种不良反应，如食欲低下、呕吐、恶心、头发脱落以及白细胞减少等都有明显的改善作用，对晚期患者有缓解疼痛作用，它还能有效地提高人体的免疫功能；而且三叶青具广谱(适用各种实体瘤和非实体瘤患者服用)，高效(能迅速改善癌性发热、疼痛、胸腹水、白细胞下降、厌食、乏力等恶病质症状，起效快，临床总有效率高)，无毒(为纯天然植物提取物，经试验无任何毒副作用)，无耐药性(能够全方位、多环节、多靶点的抑制肿瘤，与化疗药物的细胞毒作用完全不同，临床运用没有抗药情况出现)。
3.三叶青主要活性成分黄酮类物质，主要包括原花青素b1、儿茶素、原花青素b2、芦丁、异槲皮苷、山奈酚
‑3‑
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芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷等，但不同产地环境的三叶青黄酮组成存在显著差别。长期以来，三叶青药材一直依赖野生资源，非再生性采挖一方面导致野生三叶青资源蕴藏量急剧下降，许多传统产区无药可采；另一方面不同产地野生三叶青有效成分变异明显高于人工栽培，影响三叶青质量。因此，加强三叶青仿野生栽培技术研究，是三叶青可持续发展的迫切需求和有效途径。
4.三叶青适宜生长于0.7左右郁闭度的山谷、灌木丛间等腐殖质较高的林下，在阳光直射的地方偶有生长，但生长不良。随着第一批仿野生栽培三叶青进入采收期，产量低、品质差异大甚至不结块根的现象逐渐引起林农及研究人员的关注。以光照、温度、水分等环境因子对三叶青生长发育影响研究为基础的精准化栽培技术成为目前三叶青亟需解决难点。道地药材是长期适应环境胁迫的产物，林下光环境因为林冠的存在，光的组成和变化比温室和苗圃地中更为复杂，使得光因子成为影响林下三叶青药材道地性的重要因子之一。建立精准光控技术，既有助于提升林下三叶青仿野生栽培技术，也有助于提升室内栽培的质量。
5.因此，如何提供一种提升三叶青块根中黄酮含量，保证块根产量的光照控制方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明提供了一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，
通过控制光照强度和光照时间，提高了块根中黄酮的含量。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，对三叶青单株进行1500
‑
2000lux白光+0.02
‑
0.03μw/cm2紫外光的光照组合照射；其中，所述三叶青单株为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得。
9.植物通过调控苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，pal)和查尔酮合酶(chalcone synthase，chs)等系列酶基因的表达，调控黄酮的合成和积累作出应答，而这些酶的活性及其分子合成水平又受光照、温度、水分等环境因素的影响。pal和chs是黄酮合成代谢途径中两个关键酶。pal是连接初级代谢和苯丙烷类代谢，催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶和限速酶，分子量220
‑
330kda，是一种酸性蛋白。pal是目前光胁迫对黄酮积累影响研究最多的一个酶。总黄酮的含量变化趋势与pal酶活性的变化趋势基本一致，且略滞后于酶活性的变化。光胁迫首先诱导pal酶的表达实现黄酮合成代谢通路的下游支路的调整。chs是类黄酮物质生物合成途径的第一个限速酶,分子质量为42～45kda，催化丙二酰基辅酶a的3个乙酸基和对羟苯丙烯酰辅酶的一个乙酸基的缩合，产生查尔酮。光强和光质对植物体内酶活性及基因表达产生影响，随光强增大活性升高。pal活性主要受紫外光调节，chs基因表达产生mrna受蓝光、紫外光的调节，两者对光的响应较其它酶显著。迄今为止，相关领域研究人员已对拟南芥、人参、苦荞等多种植物光胁迫黄酮应答规律进行了研究，光强对不同植物黄酮类化合物的影响不同，随着光强增大多数植物黄酮类化合物含量增加。光质影响一般是短波段光可促进黄酮物质的积累，特别是紫外光uv
‑
b(280
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315nm)可显著影响黄酮类化合物(被称为uv
‑
b滤除器)积累。
10.作为本发明优选的技术方案，白光的辐照时间为8点～16点；紫外光的辐照时间为11点～13点；连续照射45天。
具体实施方式：
11.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.本发明实施例公开了一种提升三叶青中黄酮含量的方法，具体方案如下：
13.实施例1三叶青的叶、茎及块根黄酮白光胁迫下生物量及黄酮积累规律；
14.单白光照射实验：采用栽培架，每层放置50株三叶青(2年生，为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得，藤长30公分左右，叶片颜色较一致，在每层培养架中下部用铁丝网搭一平台，并将三叶青藤铺在铁丝网上，便于均匀接受光照射)，安装白光光源(40w白光荧光灯管，经紫外辐照仪测定无紫外光强度)，用光照强度测定仪测定光强(分别测定栽培架四个角及中心点的光照强度，并取平均值作为本层的光照强度值)，调节开启灯管数目及三叶青与灯管的距离，使光照强度达到设定值，每天处理8h，连续照射45天，每个处理三个重复。每隔15天，选取5株，采集叶、茎、根及块根待测。
15.对四个白光室内实验组：1000
‑
1500lux(实测值为1223lux)，1500
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2000lux(实测值为1689lux)，2500
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3000lux(实测值为2607lux)的光照实验的三叶青，每个组分别取三
盆，植株解析为叶、茎、根、块根，分别称量四个部分的鲜重及干重。
16.实验结果见表1；
17.表1
[0018][0019]
由表1可知：1000
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1500lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为12.29g，茎鲜重为12.05g，根鲜重为2.42g，块根鲜重6.61g，单株总鲜重为31.16g；1500
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2000lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为23.48g，茎鲜重为14.86g，根鲜重为7.13g，块根鲜重4.30g，单株总鲜重为49.76g。2500
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3000lux实验组，三叶青单株叶片鲜重为15.24g，茎鲜重为11.01g，根鲜重为5.22g，块根鲜重2.91g，单株总鲜重为34.37g。1500
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2000lux实验组，三叶青叶片、茎及根的鲜重均为三个组别里面最高的，但是块茎总重却低于1000
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1500lux组别，其原因为高光照强度促进了光合作用，促进了地上植株的生长，地下块茎的营养向上输送，导致块茎生长减缓。对叶片大小及叶面积进行了量测。随着光照强度增加，三叶青的叶片长度是增加的趋势，而宽度却呈减小的趋势。1000
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1500lux(实测值为1223lux)组别平均叶面积最大，其次是2500
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3000lux组，最小的为1500
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2000lux组别。
[0020]
对不同的光照下，单株中槲皮素，槲皮苷，异槲皮苷，芦丁，荭草苷及异荭草苷六种黄酮的总含量进行测定，结果见表2；以1500
‑
2000lux组别的组别最高，其中叶中平均含量为0.5035mg/g，茎中平均含量为0.2723mg/g，根中平均含量为0.0884mg/g，块根中平均含量为0.0638mg/g。
[0021]
表2
[0022][0023][0024]
实施例2三叶青叶、茎及块根pal、chs应答uv
‑
b胁迫规律；
[0025]
白光+uv
‑
b复合照射实验：采用栽培架，每层放置50株三叶青(2年生，为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得，藤长30公分左右，叶片颜色较一致，在每层培养架中下部用铁丝网搭一平台，并将三叶青藤铺在铁丝网上，便于均匀接受光照射)，安装实验光源(40w白光荧光灯管；40w紫光荧光灯管，发射光谱区域为300
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320nm)，用光照强度测定仪和紫外辐照仪测定光强(分别测定栽培架四个角及中心点的光照强度，并取平均值作为本层的强度值)，调节白光开启灯管数目及铁丝网与灯管的距离，使辐照强度达到设定值。仿照野外太阳光的规律，每天白光处理8h，紫外光辐照2h，连续
照射45天。每隔15天，选取5株，采集叶、茎、根及地下块根待测。
[0026]
具体为：
[0027]
每组50株进行紫外光胁迫实验。根据林下紫外线强度特点，采用1500
‑
2000lux的白光，结合0.01μw/cm2，0.02μw/cm2，0.05μw/cm2，0.1μw/cm2的紫外光为实验组，以1500
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2000lux的白光的为空白实验。每天紫外光辐照时间是11点
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13点，白光辐照时间为8点
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16点。辐照45天后每个实验组取样3盆，植株分解为叶、嫩茎、老茎、主根、须根、块根，测定苯丙氨酸解氨酶(pal)、查耳酮合成酶(chs)活性。结果显示叶和嫩茎中pal活性以0.1μw/cm2组别最强，分别为23.63u/g/min及16.58u/g/min，说明高紫外辐照，新生组织中pal活性强，以促进植株抵御外界逆境的能力。而老茎则以空白实验中pal活性最高，说明老茎受pal活性受逆境的影响较小。主根、须根及块根中pal活性均显著高于空白，其中0.02μw/cm2实验组中主根pal活性更是高达198.91u/g/min，0.01μw/cm2组中块根pal活性高达103.17u/g/min。老茎的chs活性也以空白最高，说明老茎受紫外光辐照影响较小。0.02μw/cm2实验组中叶chs活性最高为1.36iu/g，嫩茎中以空白最高，其次是0.01μw/cm2实验组。chs活性最强的为0.02μw/cm2实验组中的块根。
[0028]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0029]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
技术特征：
1.一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，其特征在于，对三叶青单株进行1500
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2000lux白光+0.02
‑
0.03μw/cm2紫外光的光照组合照射；其中，所述三叶青单株为将一年生三叶青苗栽植于控根容器中，在0.6～0.7郁闭度的竹林下栽培1年所得。2.根据权利要求1所述的一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，其特征在于，白光的辐照时间为8点～16点；紫外光的辐照时间为11点～13点；连续照射45天。
技术总结
本发明公开了一种提升三叶青块根中黄酮含量的室内光照控制方法，对三叶青单株进行1500
技术研发人员：韩素芳 程诗明 成亮 吴翠蓉 徐梁 徐秀荣
受保护的技术使用者：浙江省林业科学研究院
技术研发日：2021.10.15
技术公布日：2021/12/3
