本发明涉及一种蝉花的人工培养方法，具体涉及一种通过单色光进行光培养提高蝉花孢梗束质量的人工培养方法。
背景技术：
：中药蝉花为蝉棒束孢isariacicadaemiquel(蝉拟青霉paecilomycescicadae(miquel)samson)寄生在蝉若虫上形成的菌虫复合体，是我国传统著名的中药材之一，其药用比冬虫夏草早800年。蝉花属药食兼用真菌，具有较高的营养价值和特定的功效。蝉花可产生多种在医疗和保健上有重要作用的生理活性物质，包括核苷类、环肽类、多糖类、醇类、甾醇类及有机酸等，在调节免疫、改善肾功能、调节脂类代谢、抗肿瘤、抗疲劳、镇痛、催眠、降压降血糖等方面作用明显。天然蝉花资源十分有限，再加上野生蝉花因为产地不同、采收时间不一、易被杂菌污染霉变及含重金属等问题，其品质受到质疑。人工培育的蝉花不含重金属，无污染，以及营养成分稳定，因此，越来越受到人们的重视。目前，已经实现了蝉花的工厂化栽培。人工培育蝉花，是将蝉棒束孢经过斜面种子、摇瓶培养和液体深层发酵获得的液体种子接种到固体基质上先进行暗培养，之后见光培养，最终得到分叉多枝的孢梗束，经采收干燥即可作食药用原料。原料的外观性状及活性成分含量对于消费者的感官和品质认同至关重要，而不同的光质对于孢梗束颜色和有效活性成分的含量有显著影响。目前，人工培养蝉花在光培养阶段所使用的光源多为白色复合光，不利于孢梗束外观性状和质量的控制。
技术实现要素：本发明的目的在于提供一种蝉花的人工培养方法，该方法通过单色光进行光培养，提高蝉花孢梗束的外观和内在质量。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种蝉花的人工培养方法，该方法包括如下步骤：步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；步骤3，对孢梗束进行采收；其中，步骤2固体培养包括暗培养和光培养阶段，所述光培养阶段采用绿光进行照射。进一步，所述光照强度为50-200lx；更进一步，光照强度为100-200lx。进一步，步骤1所述扩大培养包括斜面培养和液体培养；更进一步，所述液体培养包括摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的任意一种或几种。进一步，步骤1扩大培养的培养温度为20～25℃。进一步，步骤2固体培养的接种量为5％～15％；更进一步，接种量为7％～12％。进一步，步骤2固体培养过程分为光培养和暗培养，暗培养阶段培养温度20-24℃，相对湿度为70-85％；光培养阶段培养温度为20-22℃，相对湿度为70-85％。进一步，步骤3对孢梗束进行采收后还包括步骤4对孢梗束进行干燥；更进一步，所述干燥方法为先将孢梗束湿度降至35～45％，再进行干燥；更进一步，干燥温度低于60℃。
本发明所述绿光为波长为577-492nm的光。本发明斜面培养、液体培养和固体培养所采用的培养基均为本领域常规培养基；所用液体培养基可以是马铃薯-蔗糖-琼脂培养基(psa)、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(pda)、马铃薯-葡萄糖-水培养基(psb)、酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基(saay)、酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基中的任意一种或几种。所述固体培养的培养基可以是谷物培养基、农作物秸杆培养基、农作物皮壳培养基、经济林木树枝培养基等。所述谷物培养基选自以小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物秸秆培养基选自以麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种为主要原料的培养基；所述农作物皮壳培养基选自以麸皮、大豆皮、棉籽壳中的任意一种或几种为主要原料的培养基。更进一步，所述固体培养基优选谷物培养基。本发明的有益效果：本发明在蝉花光培养阶段采用绿光(单色光)进行照射，相对于复合光而言能显著提高孢梗束产量；且并不影响有效成分含量。具体实施方式以下实施例1～2所用蝉花菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmcc3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)。
实施例3所用菌种为自制菌种，制备过程见实施例12；本发明研究表明蝉花菌种类型并不构成影响本发明效果的因素，本发明方法对不同蝉花菌种均能够实现效果。实施例1蝉花菌种的扩大培养斜面培养：将蝉花菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；种子罐培养：在50l气升式发酵罐中装入20l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20l；发酵罐培养：在500l气升式发酵罐中装入200l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200l种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。
终培养体积为200l。斜面试管培养基：200g土豆煮汁，20g蔗糖，20g琼脂，余补水至1000ml，ph值为6.5；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：10g酵母浸出粉，5g复合氨基酸，35g白砂糖，余量补水至1000ml，ph值为6.5。实施例2蝉花菌种的扩大培养培养过程和培养条件基本同实施例1，区别在于：斜面试管培养基为：10g酵母浸出粉，40g葡萄糖，10g蛋白胨，20g琼脂，余量补水至1000ml，ph值6.0；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：40g麸皮煮汁，30g白砂糖，余补水至1000毫升，ph值为6.5。实施例3蝉花菌种的扩大培养培养过程和培养条件基本同实施例1，区别在于：斜面试管培养基为：40g麦芽糖，10g蛋白胨，20g琼脂，余量补水至1000ml；摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：30g酵母浸出粉，30g白砂糖，5g大豆水解蛋白，余量补水至1000毫升，ph值为6.5。实施例4蝉花菌种的固体培养固体培养基的制备：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦：水为1：1.4，混合均匀；拌匀后装入培养容器中，培养基厚度控制在4cm。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30-50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按10％的接种量接种实施例1～3任一得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。培养条件：暗培养阶段培养温度为22-24℃，空气相对湿度70-85％；待菌丝体长满培养基时转为光培养，光源采用绿色单色光，光照强度100lx，培养室温度为20-22℃，相对空气湿度70％～85％。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜；至孢梗束成熟，尚未大量产生孢子(约23～26天)。实施例5蝉花菌种的固体培养培养过程基本同实施例4，区别在于固体培养基为大米和水按1:1.3的比例混合而成；光照强度50lx。实施例6蝉花菌种的固体培养培养过程基本同实施例4，区别在于固体培养基为小米和水按1:1.3的比例混合而成；光照强度200lx。实施例7蝉花菌种的固体培养培养过程基本同实施例4，区别在于固体培养基为大麦和水按1:1.3的比例混合而成。实施例8蝉花菌种的固体培养培养过程基本同实施例4，区别在于固体培养基为糙米和水按1:1.5的比例混合而成；光照强度200lx。实施例9采收及干燥对实施例4～8任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度40％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。
烘箱设置温度60℃，干燥时间8h-10h。实施例10采收及干燥对实施例4～8任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度45％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度55℃，干燥时间8h-10h。实施例11采收及干燥对实施例4～8任一培养的孢梗束进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度30％的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度60℃，干燥时间8h-10h。实施例12在我国长江以南的亚热带和热带地区低洼地带，7月，按照一般中药材的方法采集。在超镜工作台上，在无菌条件下，将采来的新鲜虫草用无菌水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分(虫体)用打湿的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的子实体下方放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约0.5cm左右。然后将培养皿放置于20℃±0.5℃的光照培养箱培养，待蝉花孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的pda培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝转另一平皿(sday培养基)培养(同上)，直至长出单一的纯化的菌落为止。
并经形态学或分子生物学方法验证，该菌株为蝉花虫草(isariacicadaemiquel)无性型。光质对孢梗束质量的影响取扩大培养得到的液体种子，分别按实施例4～8进行固体培养，按照实施例9的采收及干燥方法对孢梗束进行采收及干燥。1.光质对产量的影响计算实施例4～8每800g固体培养基(干重)孢梗束产量，结果见表1。表1光质对产量的影响结果(n＝3)结果表明，采用绿光进行光培养，单位固体培养基的孢梗束产量显著提高。此外，采用绿光进行培养还能显著降低产孢量，本发明研究表明采用白色复合光进行培养其产孢量在0.8～0.9g/800g固体培养基，而采用绿光进行培养，产孢量在0.02～0.03g/800g固体培养基，相对于白色复合光而言产孢量显著降低。产孢量降低不就使产品外观颜色好，质量优，产量稳定可控，且能明显减少生产培养过程中粉尘扩散带来的麻烦。2.光质对有效成分含量的影响取实施例1扩大培养的菌种，分别按实施例4～8进行固体培养，测定其有效成分腺苷、hea、多糖的含量。2.1检测方法2.1.1腺苷和n6-(2-羟乙基)腺苷(hea)的测定采用高效液相色谱法：色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：symmetryc18(waters，4.6mm×250mm，5μm，l.n.0264313291)；流动相：乙腈-0.04mol/l磷酸二氢钾(5:95)；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μl。
理论塔板数按腺苷峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备：取腺苷及hea对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成25μg/ml的溶液，即得。供试品溶液的制备：取0.2g蝉花子实体粉末，精密称定，置20ml具塞试管，精密加入5ml蒸馏水，超声(40khz)处理30分钟，取出，立即精密加入5ml甲醇，混匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进样时间为20min，测定，在此波长下记录对照品及供试品对应的峰面积，根据浓度换算结果进行计算，即得。2.1.2甘露醇的测定采用紫外-可见分光光度法：样品提取液的制备：精密称取0.1g蝉花子实体粉末，加入100ml70％乙醇水溶液，85-90℃水浴回流提取，溶液沸腾5min后，取出，过滤，取滤液，待滤液冷却至室温，用70％乙醇水溶液定容至100ml，摇匀，即为待测样品溶液。样品甘露醇含量测定：精密移取样品提取液1ml，置15ml具塞试管中，精密加入1ml高碘酸钾溶液，混匀，室温放置10min，再加0.1％l-鼠李糖溶液2ml以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，最后加4ml新鲜配制的nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温。
照紫外-可见分光光度法(中华人民共和国药典一部附录va)，在412nm波长处测定吸光值，带入标准曲线，求出样品甘露醇浓度(mg/ml)，再根据公式计算样品甘露醇含量(mg/g)。计算公式：2.1.3多糖的测定按照《保健食品功效成分检测方法》(白鸿主编)的方法。结果见表2。表2光质对有效成分含量的影响(n＝3)实施例腺苷(％)hea(％)甘露醇(mg/g)多糖(mg/g)实施例40.11±0.010.14±0.0182.99±4.2051.18±2.49实施例50.10±0.010.14±0.0181.24±4.1151.32±2.80实施例60.10±0.010.14±0.0181.01±3.9550.95±2.61实施例70.11±0.010.14±0.0181.17±4.0150.83±2.45实施例80.10±0.010.14±0.0180.85±3.9750.27±2.32白光0.10±0.010.17±0.0180.44±4.0054.64±2.76结果表明，采用绿光进行光培养(实施例4～8)，其孢梗束有效成分含量与白光相比无显著变化，表明采用单色光照射不影响产品内在质量。当前第1页12
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技术特征：
技术总结
本发明涉及一种蝉花的人工培养方法，所述方法包括如下步骤：步骤1，将蝉花菌种进行扩大培养；步骤2，将步骤1扩大培养得到的菌种进行固体培养；步骤3，对孢梗束进行采收；其中，步骤2固体培养包括暗培养和光培养阶段，所述光培养阶段采用绿光进行照射。本发明方法在蝉花光培养阶段采用绿光(单色光)进行照射，相对于白色复合光而言能显著提高孢梗束的产量。
技术研发人员：孙长胜;路文遥;王玉芹;纪伟;张忠亮;施伟勤;顾玲玲;谭悠久;彭国杰;闫文娟
受保护的技术使用者：浙江泛亚生物医药股份有限公司
技术研发日：2015.12.31
技术公布日：2017.07.07
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