本发明涉及品种鉴定领域，尤其涉及一种荸荠品种鉴定专用引物及其荸荠品种鉴定方法。

背景技术：

荸荠俗称马蹄，可鲜食，亦可加工，营养丰富，是广西名特优农产品和重要的出口创汇产品之一，被列为我国农业重点发展的特色农产品。

目前，广西是我国荸荠第一大产区，种植面积占全国种植面积的50％以上。但受荸荠品种单一、种性退化、抗性及大果率低等因素的影响，产业化发展受较大限制。不能根据具体的品种进行设计出相应标准化栽培技术，无法确保良种良繁。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荸荠品种鉴定专用引物及其荸荠品种鉴定方法，解决背景技术中提到的技术问题。

一种荸荠品种鉴定专用引物，所述引物序列为agagagagagagagagyc。

进一步地，所述荸荠品种包括番禺地方种、桂蹄2号和桂蹄3号。

一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：建立pcr的issr扩增体系和issr反应程序；

步骤2：对待测的荸荠品种进行dna提取，荸荠品种包括番禺地方种、桂蹄2号和桂蹄3号；

步骤3：使用步骤1中的专用引物对提取的dna为模板，进行pcr扩增；

步骤4：配制含有0.01％核酸凝胶荧光染料gelred(10000x)的1.5％琼脂糖凝胶，取pcr扩增产物于1×tbe缓冲液中电泳，待溴酚兰迁移至琼脂糖凝胶的2/3处，取出胶，而后清水漂洗，放在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。

进一步地，所述步骤1中20.0μl的issr扩增体系包括14.7μlddh2o、2.0μl10×extaqbuffer、1.6μldntp、0.5μlprimer、0.2μlextaqdnapolymerase和1.0μlgenomicdna。

进一步地，所述dntp为2.5mmol/l，所述primer为10μmol/l，所述extaqdnapolymerase为5u/μl，所述genomicdna为80ng/μl。

进一步地，所述步骤1中issr反应程序包括预变性94℃4min；40个循环，94℃30sec；40个循环，50-54℃40sec；40个循环，72℃90sec；72℃7min；最终4℃保存。

进一步地，所述步骤4中取7μl扩增产物于1×tbe缓冲液中电泳，电泳的电压为5v/cm。

本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：

本发明通过利用issr标记技术合成了一个引物(agagagagagagagagyc)，对番禺地方种，桂蹄2号和桂蹄3号进行pcr扩增，重复性好，桂蹄3号与番禺地方种比，桂蹄3号约在730bp缺失，和桂蹄2号比，桂蹄3号约在250bp基因组存在，而桂蹄2号缺失。证明桂蹄3号与番禺荸荠地方种和桂蹄2号在issr标记技术显示存在明显差异，说明引物(agagagagagagagagyc)可以鉴别以上3个品种；操作简便快速，对样本处理简单，鉴定结果高度准确。

附图说明

图1是本发明的分子标记图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

一种荸荠品种鉴定专用引物，所述引物序列为agagagagagagagagyc。引物用于鉴定的荸荠品种包括番禺地方种、桂蹄2号和桂蹄3号。

一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，包括如下步骤：

一、issr技术体系的建立

建立如下issr扩增体系：

注：pcr的反应液在冰浴中配制，然后置于pcr仪上进行pcr反应。

二、issr反应程序

改进后的反应程序为：

三、电泳检测

配制含有0.01％核酸凝胶荧光染料gelred(10000x)的1.5％琼脂糖凝胶，取7μl扩增产物于1×tbe缓冲液中电泳，电泳的电压为5v/cm，待溴酚兰迁移至琼脂糖凝胶的2/3处，取出胶，而后清水漂洗，放在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。

四、结果：

利用issr标记技术合成了一个引物(agagagagagagagagyc)，对番禺地方种，桂蹄2号和桂蹄3号进行pcr扩增，重复性好，如图1。桂蹄3号与番禺地方种比，桂蹄3号约在730bp缺失，和桂蹄2号比，桂蹄3号约在250bp基因组存在，而桂蹄2号缺失。证明桂蹄3号与番禺荸荠地方种和桂蹄2号在issr标记技术显示存在明显差异。说明引物(agagagagagagagagyc)可以鉴别以上3个品种。图1中标记m为dl2000标准分子量；1为番禺地方种；2为桂蹄2号；3为桂蹄3号。两个箭头指向的位置说明：桂蹄3号与番禺地方种比，桂蹄3号约在730bp缺失，和桂蹄2号比，桂蹄3号约在250bp基因组存在，而桂蹄2号缺失。

左边的2000bp、1500bp：标记m为dl2000标准分子量，250bp、500bp、750bp、1500bp、2000bp作为标准，为右边的1、2、3参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种荸荠品种鉴定专用引物，其特征在于：所述引物序列为agagagagagagagagyc。

2.根据权利要求1所述的一种荸荠品种鉴定专用引物，其特征在于：所述荸荠品种包括番禺地方种、桂蹄2号和桂蹄3号。

3.根据权利要求1所述的一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

步骤1：建立pcr的issr扩增体系和issr反应程序；

步骤2：对待测的荸荠品种进行dna提取，荸荠品种包括番禺地方种、桂蹄2号和桂蹄3号；

步骤3：使用步骤1中的专用引物对提取的dna为模板，进行pcr扩增；

步骤4：配制含有0.01％核酸凝胶荧光染料gelred(10000x)的1.5％琼脂糖凝胶，取pcr扩增产物于1×tbe缓冲液中电泳，待溴酚兰迁移至琼脂糖凝胶的2/3处，取出胶，而后清水漂洗，放在自动凝胶成像仪中观察、拍照记录。

4.根据权利要求3所述的一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中20.0μl的issr扩增体系包括14.7μlddh2o、2.0μl10×extaqbuffer、1.6μldntp、0.5μlprimer、0.2μlextaqdnapolymerase和1.0μlgenomicdna。

5.根据权利要求4所述的一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，其特征在于：所述dntp为2.5mmol/l，所述primer为10μmol/l，所述extaqdnapolymerase为5u/μl，所述genomicdna为80ng/μl。

6.根据权利要求5所述的一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中issr反应程序包括预变性94℃4min；40个循环，94℃30sec；40个循环，50-54℃40sec；40个循环，72℃90sec；72℃7min；最终4℃保存。

7.根据权利要求5所述的一种荸荠品种鉴定专用引物的荸荠品种鉴定方法，其特征在于：所述步骤4中取7μl扩增产物于1×tbe缓冲液中电泳，电泳的电压为5v/cm。

技术总结

本发明公开了一种荸荠品种鉴定专用引物及其荸荠品种鉴定方法，属于品种鉴定领域，引物序列为AGAGAGAGAGAGAGAGYC。通过利用ISSR标志技术合成引物，对番禺地方种，桂蹄2号和桂蹄3号进行PCR扩增，重复性好，桂蹄3号与番禺地方种比，桂蹄3号约在730bp缺失，和桂蹄2号比，桂蹄3号约在250bp基因组存在，而桂蹄2号缺失。证明桂蹄3号与番禺荸荠地方种和桂蹄2号在ISSR标记技术显示存在明显差异，说明引物可以鉴别以上3个品种；操作简便快速，对样本处理简单，鉴定结果高度准确。

技术研发人员：江文;高美萍;黄诚梅;陈丽娟;蔡炳华

受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院

技术研发日：2020.07.02

技术公布日：2020.08.18