【摘要】：花生是重要的油料作物,它富含优质蛋白和脂肪,是人们健身增寿的食疗保健佳品。花生籽粒油脂的品质是由脂肪酸的组成决定的,高油酸的花生稳定性好、营养价值高,越来越受到人们的喜爱。因而,提高油酸的相对含量,增加油酸/亚油酸(O/L)的比值,已成为目前油料作物育种的重要内容,与此同时与油酸积累相关的两个关键酶——硬脂酰ACP脱氢酶(stearoyl–acyl carrier protein (ACP) desaturase,SAD)和微粒体△~(12)脂肪酸脱氢酶(delta 12 fatty acid desaturase,Δ~(12)FAD或FAD2)引起了众多研究者的关注。SAD催化硬脂酰基的第9-10碳原子间脱氢形成第一个双键,产生油酰基载体蛋白。它是油酸积累的关键酶,在决定植物饱和和不饱和脂肪酸的比例上起重要作用,它对植物的生理功能也有重要影响。本实验利用同源克隆方法,从花生鲁花14中克隆得到了两个AhSAD基因,分别将它们命名为AhSAD1-1和AhSAD1-2。对AhSAD1基因的cDNA序列进行较系统的生物信息学分析,包括多序列比对、同源性分析、蛋白质理化特性以及结构预测与特征分析,结果表明AhSAD1和其它植物的SAD氨基酸序列间有很高的同源性,在所比较的SAD中,AhSAD1和它们的同源性都在73%以上。

具功能的AhSAD1分子是一个同型二聚体,它在进化上较为保守,含一个属于酰基ACP脱氢酶(Acyl-Acyl Carrier Protein Desaturase, AAD)家族和类铁蛋白(Ferritin-1ike)家族的保守结构域。基因表达模式分析显示,AhSAD1在发育的种子中的表达量最高,且在果针入土50天后达到最高峰,结合花生种子发育过程中硬脂酸和油酸积累发展趋势,说明该基因在调控脂肪酸积累和组成上具有重要作用。同时,为了进一步研究鲁花14中两种AhSAD1蛋白的具体功能,我们构建了CaMV35S启动子驱动的过量表达AhSAD1基因的植物过量表达载体pCAMBIA3301-35S-AhSAD1-1和pCAMBIA3301-35S-AhSAD1-2。利用农杆菌介导法分别将它们导入拟南芥、烟草、花生,经检测证明,该基因已经成功整合入烟草、花生基因组中,为进一步选育性状优良的高油酸花生品种奠定了基础。FAD2催化油酸在碳12位上脱氢生成亚油酸,是控制籽粒油酸、亚油酸含量和O/L比值的关键酶。为了深入了解控制花生O/L比值的遗传基础,提高花生品质育种效率,本实验室对鲁花14等13个花生栽培品种Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2基因的编码区进行了序列分析。

结果表明:该基因在13个花生品种中皆存在3类转录本:即AhFAD2A、AhFAD2B和AhFAD2C。临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23这些品种在AhFAD2A基因448位点存在G→A点突变,该突变导致编码酶活几尽丧失,鲁花11在此位点为G/A杂合,除此之外AhFAD2A基因在某些品种的其他8个位点也存在多态性。AhFAD2B基因相对保守,所测13个花生品种的核苷酸序列基本相同;AhFAD2C基因的G451T点突变,形成TAA终止子;或674~680 bp之间7 bp的片段插入,导致移码,形成TGA终止子,使得AhFAD2C不能编码完整蛋白,为假基因。OL1编码具有活性的AhFAD2A脱氢酶,OL2编码AhFAD2B脱氢酶。ol1是AhFAD2A的一个突变等位基因;ol2是AhFAD2B的隐性等位基因。故我们认为,台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、白沙1016的基因型是OL1OL1OL2OL2;临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23的基因型是ol1ol1OL2OL2;鲁花11的基因型可能存在OL1ol1杂合等位位点。结合对这些品种籽粒中脂肪酸的组分气相色谱分析发现,籽粒O/L比值大于1.5的品种临桂麻壳、勾了种、鲁花11、鲁花14、花育19、花育23 AhFAD2A基因在448位点也存在G→A点突变,这表明AhFAD2A基因G448A点突变是造成花生品种籽粒的O/L比值相对提高的因素之一。本研究同时对假基因可能存在的功能进行了讨论。