本发明属于鳄鱼油的制备方法，特别指鳄鱼油的高效生物制备方法。
背景技术：
鳄鱼与已经灭绝的恐龙属于近亲，是最古老的爬行动物，在地球上已经生存了2亿3千多万年，因而具有“活化石”之称。鳄鱼属爬行纲、鳄目。共有3科8属25种，世界上现存仅有3科21种。研究表明，鳄鱼全身都是宝，具有极高的药理及滋补、商业价值，此外鳄鱼还具有强大的自身免疫系统。近几年来，国际市场对鳄鱼类的制品需求日增长，鳄鱼是近年来开发的新型养殖经济动物。
李时珍的《本草纲目》中记载，鳄鱼油脂主治皮肤病和恶疮。现代医学实验证明，鳄鱼油有抑菌消炎、防皮肤冻伤和促进皮肤烧伤创面修复等作用，目前在多种国际知名化妆品及防冻伤和消炎等保健产品中均有应用。研究显示，鳄鱼油能加速大鼠深二度烧伤的治愈，减少疤痕形成，其机理在于鳄鱼油能显著降低疤痕形成转化生长因子β1(tgf-β1)的表达从而减少疤痕的形成，其效果好于传统的西药磺胺嘧啶银。鳄鱼油中含有丰富的epa（二十碳五烯酸）、dha（二十二碳六烯酸）等多种不饱和脂肪酸，具有调节血脂、防止血液凝固、预防阿尔兹海默症、提高记忆力、抗癌、提高免疫力等生理活性。研究表明尼罗鳄油具有抗菌与抗炎活性，从中鉴定了16种脂肪酸，其中以油酸、棕榈酸和亚油酸为主要成分。暹罗鳄鱼油的化学成分中不饱和脂肪酸含量高达49.67%，其中单不饱和脂肪酸36.86%、多不饱和脂肪酸12.81%，在不饱和脂肪酸中，含油酸30.47%、亚油酸11.74%、棕榈油酸5.67%。
目前，对鳄鱼油的提取与精致方法和工艺的研究很少，鳄鱼油提取的方法主要有碱水解法、有机溶剂提取法、减压蒸馏法、超临界co2萃取法、干法熬制等。但上述这些方法均有严重的不足，如碱水解法、有机溶剂提取法均会容易造成溶剂残留和环境污染等问题；减压蒸馏需要特殊的仪器设备且提取率低；超临界co2萃取法仪器昂贵，提取时间长，能耗大，提取率低；干法熬制缺点是提取温度高，不饱和脂肪酸易遭到破坏，颜色深，腥味重。鱼油的脱色方法有使用活性炭、活性白土等，在脱腥方面的研究中大多采用物理和化学方法，活性炭脱腥效果较好，但蛋白质损失较多，分离困难，化学试剂脱腥后鱼油的成分破坏严重。在针对鳄鱼油脱色脱腥专利检索中有一篇cn201310451356.2专利使用的是活性炭和活性白土脱色，加酸加减的化学方法脱腥，没有提取方法。而且，鳄鱼油含有大量的具有医药保健功能的不饱和脂肪酸，很容易被氧化失活，因此，制备具有完整生物活性成分的高品质鳄鱼油是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于优化了一种工艺简单、提取温度低、提取时间短、提取率高，纯化过程温和，最大可能保留活性成分不被破坏，环境友好的一种新的鳄鱼油的高效生物制备方法，减少珍贵的鳄鱼资源的浪费，为在食品、药品、保健品以及日化产品中的应用提供本发明方法制备的优质鳄鱼油。
本发明通过以下工艺实现：
鳄鱼脂肪的准备：鳄鱼脂肪组织用清水冲洗干净，在室温下用剪刀或刀分成小块，再用组织捣碎机或绞肉机将脂肪搅碎成脂肪糜，4℃下保存备用。
鳄鱼油的提取：按料液比1:1~3(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水（包括自来水、过滤水、生理盐水、矿泉水、蒸馏水和缓冲溶液中的一种，下同）到烧杯中，加入0.5%~2.5％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值为6~8，将烧杯放入45~65℃恒温磁力搅拌器中水浴1~5h，期间不停搅拌，酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，3000~5000r/min离心5~20min，取上清，得鳄鱼原油。
优选的，鳄鱼油的提取方案为：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值为7~8，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴2~4h，期间不停搅拌，酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，3500~4500r/min离心10~20min，取上清，得鳄鱼原油。
进一步优选的，鳄鱼油的提取方案为：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值为7.5，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴3~4h，期间不停搅拌，酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，3500~4500r/min离心10~20min，取上清，得鳄鱼原油。
更进一步优选的，鳄鱼油的提取方案为：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值为7.5，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴4h，期间不停搅拌，酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
鳄鱼油的脱色：取2中的鳄鱼原油，加入3%~7%（w/v）的硅胶。45~55℃脱色40~70min，然后以3000~5000r/min离心5~20min，取上清，得脱色鳄鱼油。
优选的，鳄鱼油的脱色方案为：取2中的鳄鱼原油，加入4%~6%（w/v）的硅胶，45~55℃脱色50~70min，然后以3500~4500r/min离心10~20min。取上清，得脱色鳄鱼油。
进一步优选的，鳄鱼油的脱色方案为：取2中的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的硅胶。50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
鳄鱼油的脱腥：取3中的鳄鱼油，40%~60%（v/v）的清水，0.5%~2%（w/v）的酵母粉和1%~3%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中，温度30~40℃，发酵3h~5h后，3000~5000r/min离心10~20min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
优选的，鳄鱼油的脱腥方案为：取3中的鳄鱼油，45%~55%（v/v）的清水，0.5%~1.5%（w/v）的酵母粉和1.5%~2.5%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中，温度35~40℃，发酵3h~5h后，3500~4500r/min离心10~20min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
进一步优选的，鳄鱼油的脱腥方案为：取3中的鳄鱼油，50%（v/v）的清水，1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中，温度37℃，发酵4h~5h后，3500r/min离心15min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
本发明的原理是利用蛋白酶对蛋白质的水解破坏蛋白质和脂肪的结合关系，从而释放出油脂，然后利用硅胶的吸附作用对对鳄鱼油脱色，再利用微生物发酵的方法进行脱腥，最后的到品质较高的鳄鱼油。该方法作用温和，产油质量高，脱腥和脱色效果好，工艺简单，成本低。
具体实施方式
为便于更好地理解本发明，通过以下实施例进一步说明，这些实施例属于本发明的保护范围，但不限于本发明的保护范围。
实施例1
鳄鱼脂肪的准备：鳄鱼脂肪用清水洗净，在室温下用剪刀或刀分成小块，再用组织捣碎机或绞肉机打碎脂肪成糜状，4℃下保存备用。
鳄鱼油的提取：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值至7.5，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴2h，期间不停搅拌。酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
鳄鱼油的脱色：取上一步的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的硅胶，混匀后50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
鳄鱼油的脱腥：取上一步脱色鳄鱼油，50%（v/v）的清水，1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中。温度37℃，发酵1h后，3500r/min离心15min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
实施例2
具体操作与实施例1基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为2h。
实施例3
具体操作与实施例1基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为3h。
实施例4
具体操作与实施例1基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为4h。
实施例5
鳄鱼脂肪的准备：鳄鱼脂肪用清水洗净，在室温下用剪刀或刀分成小块，再用组织捣碎机或绞肉机打碎脂肪成糜状，4℃下保存备用。
鳄鱼油的提取：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值至7.5，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴3h，期间不停搅拌。酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
鳄鱼油的脱色：取上一步的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的硅胶，混匀后50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
鳄鱼油的脱腥：取上一步脱色鳄鱼油，50%（v/v）的清水，1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中。温度37℃，发酵1h后，3500r/min离心15min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
实施例6
具体操作与实施例5基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为2h。
实施例7
具体操作与实施例5基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为3h。
实施例8
具体操作与实施例5基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为4h。
实施例9
鳄鱼脂肪的准备：鳄鱼脂肪用清水洗净，在室温下用剪刀或刀分成小块，再用组织捣碎机或绞肉机打碎脂肪成糜状，4℃下保存备用。
鳄鱼油的提取：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)木瓜蛋白酶，调节ph值至7.5，将烧杯放入55℃恒温磁力搅拌器中水浴4h，期间不停搅拌。酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
鳄鱼油的脱色：取上一步的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的硅胶，混匀后50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
鳄鱼油的脱腥：取上一步的脱色鳄鱼油，50%（v/v）的清水，1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的葡萄糖，先将葡萄糖和酵母粉溶解于清水中，然后再加入到鳄鱼油中。温度37℃，发酵1h后，3500r/min离心15min，取上清，得脱腥鳄鱼油。
实施例10
具体操作与实施例9基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为2h。
实施例11
具体操作与实施例9基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为3h。
实施例12
具体操作与实施例9基本相同，仅将脱腥步骤中的发酵时间改为4h。
对比实验验证：
鳄鱼油提取的对比实验：
对比实验一：按料液比1:1(w/v)称取准备好的脂肪糜和清水到烧杯中，加入1.25％(w/w)胃蛋白酶，调节ph值为2.5，做三个时间梯度，将烧杯放入45℃恒温磁力搅拌器中分别水浴2h、3h、4h，期间不停搅拌。酶解结束后升高温度至80℃以上终止反应，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
对比实验二：取备用的鳄鱼脂肪150.0g，放于烧杯中，按料液比1:3(w/v)加入450.0ml清水于烧杯中，做三个时间梯度，放入微波炉中分别加热10min、12min、14min后停止加热，取出烧杯，稍微凉冷至不烫手，4000r/min离心15min，取上清，得鳄鱼原油。
鳄鱼油取率的测定：以所得鱼油质量除以提取鱼油使用鳄鱼脂肪的质量计算鱼油的提取率。提取率计算公式：提取率（%）=鳄鱼油的质量/鳄鱼脂肪的质量×100%。
实验结果：由表1和表2木瓜蛋白酶、胃蛋白酶对鳄鱼油的提取率和微波法对鳄鱼油的提取率显示，微波法14min提取率与木瓜蛋白酶4h的提取率相接近，但比木瓜蛋白酶略低，但是微波法提取的鱼油色泽深，腥味大；相同时间下木瓜蛋白酶的鳄鱼油提取率远高于胃蛋白酶，因此该发明选用木瓜蛋白酶提取鳄鱼油。不同时间木瓜蛋白酶对鳄鱼油提取率的影响如表3所示，通过统计分析，2h与3h、3h与4h之间鳄鱼油的提取率无显著性差异（p>0.05）；2h与4h之间鳄鱼油的提取率差异显著（p<0.05）；所以最适的提取时间为3h，该发明方法作用温和，产油质量高，鳄鱼油提取效率高，工艺简单，成本低。
表1相同时间木瓜蛋白酶及胃蛋白酶对鳄鱼油提取率的影响
表2微波法不同时间对鳄鱼油提取率的影响
表3时间对鳄鱼油提取率的影响（n=3）
注：表中第一组、第二组和第三组为平行重复实验，字母代表多重统计分析的结果，不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，出现相同的字母表示差异不显著（p>0.05）。
鳄鱼油脱色的对比实验：
对比实验一：取2中的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的高岭土。50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
对比实验二：取2中的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的硅藻土。50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
对比实验三：取2中的鳄鱼原油，加入5%（w/v）的活性炭。50℃脱色60min，然后以4000r/min离心15min，取上清，得脱色鳄鱼油。
实验结果：四种吸附材料脱色效果依次为硅胶>高岭土≥硅藻土>活性炭，即硅胶脱色效果最好，与高岭土和硅藻土脱色效果相差不明显，它们均使鳄鱼油由原来淡黄色转为无色（液体状态下），但活性炭脱色效果最差。
鳄鱼油脱腥的对比实验：
对比实验一：找40名志愿者随机编号后输入电脑excel表中，再随机分为4组每组10人，然后随机给到一组志愿者相同的处理过的鳄鱼油。感官评价由选出的10名志愿者对处理好的鳄鱼油进行打分。在评定的过程中不能够相互交流，志愿者均不知道手中样品是哪一组，每次对一个样品评定结束后，再闻一下蒸馏水后间隔几分钟再进行下一个样品的打分，以蒸馏水作为参照(分值为10)进行打分，根据表4的评分标准进行打分。
实验结果：发酵脱腥效果如表5所示，发酵1h平均分最低（3.7分），属于腥味较浓；发酵4h平均分最高（7.3分），腥味较淡，说明在相同条件下，发酵4h的脱腥效果最好。发酵3h与发酵1h脱腥效果具有显著差异(p<0.05)，而发酵4h与发酵1h脱腥效果有极显著性差异（p<0.01）。
表4鳄鱼油脱腥处理感官评价标准
表5生物发酵感官评价（n=10）
注：表中的不同字母代表多重统计分析的结果，采用lsd法，组间有不同的小写或大字母表示差异显著（p<0.05）或差异极显著（p<0.01），有相同的小写或大字母表示无显著性差异（p>0.05）或极显著性差异（p>0.01）。
技术特征：
技术总结
本发明公开了一种鳄鱼油及其高效生物制备方法，属于鳄鱼脂肪加工领域。鳄鱼油含有大量的具有医药保健功能的不饱和脂肪酸，很容易被氧化失活，为了解决传统鳄鱼油提取效率低、过程繁琐、鱼油质量差，脱色和脱腥过程复杂，对鳄鱼油的成分破坏严重等问题，本发明提供一种高效、快速、低成本、高质量的鳄鱼油的制备方法，包括生物酶提取、物理吸附脱色、微生物发酵脱腥，条件温和。对于充分利用宝贵的鳄鱼油资源，制备高质量的鳄鱼油具有重要意义，为鳄鱼油在药品、保健品、食品以及日化产品中的应用提供保障。
技术研发人员：冯昆;郑春辉;杨芳;刘洋;方朋超;李志梅
受保护的技术使用者：遵义医学院
技术研发日：2017.10.17
技术公布日：2017.12.26
