中草药及复方对嗜水气单胞菌体外抑菌作用研究

陶 莎，张效平，商宝娣，李小义，姚俊杰

( 1.贵州省农业科学院 水产研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 渔业资源与环境研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省特种水产工程技术中心，贵州 贵阳 550025 )

目前，在我国水产养殖鱼类细菌疾病的治疗中，抗生素药品仍为治疗首选，但长期使用易导致病原菌出现耐药性和药物残留问题[4]。中草药含有丰富的生物活性物质和营养成分，既可提高消化酶活性，促进营养物质消化吸收，进而提高水产动物生长性能，又可提高水产动物非特异性免疫功能，增强其抗菌、抗病能力；中草药还具有毒副作用小、无残留等优点[5-7]。笔者采用水煎法获得41种中草药的提取物，测定41种中草药提取物及其复方

对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果，筛选出能有效抑制嗜水气单胞菌的中草药及复方，为养殖斑点叉尾因嗜水气单胞菌感染引起疾病的临床治疗提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

41种中草药为：金银花、夏枯草、石榴皮、大黄、诃子、败酱草、熟地黄、地榆、黄苓、杜仲、黄柏、紫花地丁、大青叶、苏木、枸杞、丹参、柴胡、板蓝根、厚朴、穿心莲、黄连、五倍子、石菖蒲、青皮、连翘、乌梅、高良姜、肉桂、苦参、茯苓、地肤子、牡丹皮、陈皮、蛇床子、姜黄、猪苓、黄芪、藿香、公丁香、小茴香、昆布。均购自本地中药房。

MH营养琼脂、LB营养琼脂、LB营养肉汤为自行配制，96孔板、牛津杯及其他试验耗材购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验菌株液制备

1.2.2 中草药提取物制备

50 g中草药置于1000 mL双蒸水中浸泡1 h后，大火煮沸转小火熬制2 h，三层纱布过滤药液，剩余药渣再加入1000 mL双蒸水浸泡1 h，重复第一次熬制过程，合并两次药液，小火加热浓缩至50 mL，使药液终质量浓度为1 g/mL(即1000 mg/mL)，121 ℃灭菌20 min，置于4 ℃备用。

1.2.3 中草药抑菌圈测定

采取琼脂平板打孔法测定抑菌圈大小。灭菌培养皿中一次性倒入约10 mL灭菌LB液，待底层凝固后，均匀放置4个灭菌的牛津杯，倒入LB营养琼脂10～15 mL，待凝固后，用无菌棉棒蘸取密度为1×107cfu/mL的菌液500 μL，均匀涂抹在牛津杯以外的培养面上，待菌液完全吸收后，用镊子小心取出牛津杯，往孔中加入80 μL制备好的中草药提取物，每个平板中3个平行，第4个孔加入80 μL灭菌水作对照，28 ℃正置培养24 h后取出测量抑菌圈直径。抑菌圈直径(d)评定标准参照文献[1]：d≥20 mm 为极敏(S++)，20 mm>d≥15 mm为高敏(S+)，15 mm>d≥10 mm 为中敏(S)，d

1.2.4 最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度的测定

最小抑菌质量浓度(MIC)：采用96孔板微量肉汤稀释法测定。无菌条件下，取干净96孔酶标板(12×8)，每孔加入灭菌MH肉汤100 μL。第1～3列第1行加入制备好的中草药提取物100 μL，充分混匀后，逐次倍比稀释至第11列(每孔液体终体积100 μL，最后一列稀释完后吸出100 μL)，使1～11列提取物质量浓度分别为500 mg/mL(2倍稀释)、250 mg/mL(4倍稀释)、125 mg/mL(8倍稀释)、62.5 mg/mL(16倍稀释)、31.25 mg/mL(32倍稀释)、15.63 mg/mL(64倍稀释)、7.81 mg/mL(128倍稀释)、3.91 mg/mL(256倍稀释)、1.95 mg/mL(512倍稀释)、0.98 mg/mL(1024倍稀释)、0.49 mg/mL(2048倍稀释)；1～3行的1～11孔加入稀释过的菌悬液10 μL，第12孔不加入菌液，做阴性对照，第4行的1～11孔不加入菌液，作为对照查看是否生长细菌，第12孔加入100 μL菌液，做阳性对照，一板一药，28 ℃正置培养24 h后，取出观察结果，前3行与第4行透明度相似的质量浓度即为最小抑菌质量浓度。

最小杀菌质量浓度(MBC)：选择高于最小抑菌质量浓度的质量浓度组，用无菌棉棒蘸取孔中的液体，均匀涂于培养皿中，28 ℃倒置培养18 h后取出观察结果，少于5个单菌落试验组的质量浓度即为该药的最小杀菌质量浓度。

1.2.5 药物联用试验

根据上述试验结果得出效果较好的单方中草药，将选出的中草药进行两两联合试验。试验分为两部分：联用药物对抑菌圈的影响和联用药物最小抑菌质量浓度与最小杀菌质量浓度的测定，根据结果综合分析联用效果，为下一步筛选复方中草药提供依据。

联用抑菌圈效果：培养基的制备类似牛津杯打孔培养基，区别是将两个孔之间的距离缩短约5 mm，两孔中分别加入不同的单方中草药提取物A与提取物B各80 μL，其余操作同1.2.3，中草药两两结合，正置培养，28 ℃培养 24 h，观察两抑菌圈交会处，判断其联用效果。联用效果包括协同作用(++)、相加作用(+)、无相关作用(-)和拮抗作用(--)。

联用最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度的测定采用棋盘交叉法。将筛选出的抑菌效果较好的单方中草药进行两两联合抑菌试验，以2MIC的质量浓度为初始质量浓度，用灭菌MH营养肉汤进行2倍稀释，配制每种药的质量浓度梯度为：2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC，配制完成的2种单方中草药按照表1进行混合，各加入500 μL，然后在每孔中加入1%红四氮唑溶液5 μL，检验细菌是否生长(红四氮唑检验原理：细菌生长过程伴随着糖类脱氢，红四氮唑与氢结合发生反应，使培养基发红)。联合抑菌试验以部分抑菌指数(FIC)作为判定依据，部分抑菌指数计算方法如下：

表1 棋盘交叉法图示Tab.1 The graphical representation of board cross

FIC≤0.5为协同作用，0.5