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专利名称:羌活组织培养繁殖方法
技术领域:
本发明涉及生物的培养和繁殖,特别是一种羌活组织培养繁殖方法。
背景技术:
羌活是伞形科(Umbelliferae)多年生野生药材,是我国的特有植物物种,是中藏羌药中最常用的药材之一。羌活以根状茎及根入药,味辛、性温,有散表寒、祛风湿、利关节等功效,主治感冒风湿、发热头痛、皮肤骚痒、风水浮肿、痈疽疮毒等症。我国历版药典对羌活均有收载,据《中华人民共和国药典》2005年版一部,为伞形科(Umbelliferae),开发历史悠久,药材商品有蚕羌、竹节羌、头羌、条羌及羌王。四川是羌活的道地产区,,销全国并出口,主产甘孜、阿坝、凉山三州等地2700米以上高海拔山区。
长期以来,由于其来源完全依赖野生采挖,种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少,尤其是近年来随着国内外对羌活需求量的增加,供需矛盾日益突出,加之利益驱使,大量掠夺性采挖,使羌活逐渐成为濒临植物,面临物种丧失,资源枯竭的危险,进行种质保护和扩大羌活繁育势在必行。
植物组织培养技术是利用细胞的全能性(个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。),取植物个体上的细胞团或组织,通过人工配制的培养基,使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组培进行离体快繁在以下三方面有重要意义(1)繁殖速度快,不受气候因素影响,一年四季在室内均可繁殖;(2)便于保持优良种性;(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义,一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广。
其他高山野生药材,如红景天等的组织培养已有文献报道,但野生羌活组织培养尚未见报道。从野外采集的外植体,其表面易滋生细菌和真菌等微生物,有的甚至长到组织内部(内生菌);加之,羌活所含醌类、酚类物质较多,很易氧化变褐,因此对外植体材料的选择和消毒方法都非常关键。本发明首次采用组织培养方法,开展野生羌活种质离体繁殖工作,这为挽救濒危羌活材料,开展野生羌活遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过组织培养进行羌活种质保存和快速繁苗方法。
本发明的技术方案是一种羌活组织培养繁殖方法,其特征在于以羌活萌发的根芽为外植体,经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后,再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养,长成完整的植株
小苗,将完整小苗移栽到育苗基质中,长成正常羌活植株。
所述的羌活组织培养繁殖方法,包括下列步骤A、外植体的选择和消毒处理以羌活萌发的根芽为外植体,以流水冲洗3~5分钟,再用浓度为75%的酒精浸泡灭菌45~60秒,以无菌去离子水冲洗2~3次,%~%的升***中,浸泡灭菌10~14分钟,无菌去离子水冲洗2~3次,备用;B、~,接种在愈伤组织诱导培养基上,培养时间为30~35天,在根芽切口处膨大形成愈伤组织;C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,愈伤组织增殖25~35天,长出黄色、致密的愈伤组织;D、愈伤组织的芽诱导将步骤C中得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上,培养35~45天,出现丛生羌活苗;E、生根培养将步骤D中得到的丛生羌活苗分株,转入生根培养基中,培养20~30天,小苗基部出现白色短根并长出完整根系;F、植株移栽移栽前,对含蛭石、泥炭的育苗基质消毒,将步骤E中得到的完整小苗直接移栽到育苗基质,无需炼苗可直接成活,长成正常羌活植株。
所述的外植体消毒处理采用75%酒精浸泡灭菌45~60秒和
%~%升***浸泡灭菌10~14分钟的双重两次消毒方法。
所述的致密的愈伤组织是指非颗粒状散在的愈伤组织。
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所述的愈伤组织诱导培养基为MS、~、2,4-~、~,其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962,KT为6-糠基腺嘌呤(激动素),2,4-D为2,4-二***苯氧乙酸,NAA为萘乙酸。
所述的愈伤组织增殖培养基为MS、~、2,4-~,其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962,KT为6-糠基腺嘌呤,2,4-D为2,4-二***苯氧乙酸。
所述的诱芽培养基为MS、6-~、~,其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962,6-BA为6-苄基腺嘌呤,NAA为萘乙酸。
所述的生根培养基为1/2MS、~、2~3%的蔗糖、%的琼脂,其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962,将该常规基本培养基中的大量元素浓度减半得到1/2MS,NAA为萘乙酸。
所述的愈伤组织诱导培养基、~%的琼脂、3%~%活性炭。
所述的MS培养基的成分按常规为***铵(NH4NO3)1650mg/L,***钾(KNO3)900mg/L,硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L,***化钙(CaCl2·2H2O)440mg/L,硫酸锰(MnSO4·4H2O),硫酸锌(ZnSO4·7H2O),硼酸(H3BO3),碘化钾(KI),钼酸钠(Na2MoO4·2H2O),硫酸铜(CuSO4·5H2O),***化钴(CoCl2·6H2O),硫酸亚铁(FeSO4·7H2O),Na2·EDTA·,甘氨酸2mg/L,盐酸硫***,,,肌醇100mg/L。
所述的完整小苗是指完成了芽和根的分化,并已长出小叶片,可以独立进行自养生长的幼小植株。
所述的育苗基质的理化性质为总孔隙度为75%,有机质含量为20%。
本发明的优点在于本发明利用组织培养进行离体快速繁殖在以下三方面有重要意义(1)繁殖速度快,不受气候因素影响,一年四季在室内均可繁殖,即启动快;(2)便于保持优良种性,即同步性好;(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义,一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广。
本发明所用培养基诱发时间短、出苗快、增殖频率高,尤其出苗齐,无需炼苗可直接成活,易于操作,进行大规模生产。
本发明首次采用组织培养方法,开展野生羌活种质离体繁殖工作,这为挽救濒危羌活种质资源,开展野生羌活遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径,提供了一种能进行羌活的人工繁殖、种质资源离体保存、利用及选育药用成分含量高的突变系的组织培养方法。
具体实施例方式
实施例1一种羌活组织培养繁殖方法,包括下列步骤A、,用流水冲洗3~5分钟,再用75%的酒精灭菌50秒,以无菌去离子水冲洗2~3次,%的升***,灭菌14分钟,无菌去离子水冲洗2次,最后用无菌滤纸吸干水分备用;B、外植体接种在超净工作台上,~,接种在愈伤组织诱导培养基上,该培养基为MS++2,4-+,%的琼脂、3%%的活性炭,培养约35天后,可见在根芽切口处膨大形成愈伤组织;所述的超净工作台,型号为HS-1300,由苏静集团苏州安泰空气技术有限公司生产,
所述的MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962的简称,KT为6-糠基腺嘌呤,2,4-D为2,4-二***苯氧乙酸,NAA为萘乙酸;C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,该培养基为MS++2,4-,%的琼脂、3%%的活性炭,增殖培养30~32天后,长出黄色、致密的愈伤组织;D、愈伤组织的芽诱导将步骤C中得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上,该培养基为MS+6-+,%的琼脂、3%%的活性炭,培养35~45天后,出现丛生羌活苗;E、生根培养将步骤D中的丛生羌活苗长至2~3厘米时,转入生根培养基,该培养基为1/2MS+,培养基中加入2%的蔗糖、%的琼脂,培养20~30天后,小苗基部出现白色短根并长出完整根系;培养温度及光照条件温度为21±2℃,光照强度为1600Lux,光照时间为14小时;F、植株移栽移栽前,对含蛭石、泥炭的育苗基质消毒,将步骤E中得到的完整小苗直接移栽到育苗基质,无需炼苗可直接成活长成正常羌活植株,一般成活率在80%以上。
所述的育苗基质的理化性质为总孔隙度为75%,有机质含量为20%。
实施例2一种羌活组织培养繁殖方法,包括下列步骤A、取羌活
,用流水冲洗3~5分钟,再用75%的酒精灭菌50秒,以无菌去离子水冲洗3次,%的升***,灭菌12分钟,无菌去离子水冲洗3次,最后用无菌滤纸吸干水分备用;B、外植体接种在超净工作台上,~,接种在愈伤组织诱导培养基上,该培养基为MS++2,4-+,%的琼脂、3%%的活性炭,培养30~35天后,在根芽切口处膨大形成愈伤组织;所述的超净工作台,型号为HS-1300,由苏静集团苏州安泰空气技术有限公司生产;所述的MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962的简称,KT为6-糠基腺嘌呤,2,4-D为2,4-二***苯氧乙酸,NAA为萘乙酸;C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,该培养基为MS++2,4-,%的琼脂、3%%的活性炭,增殖培养35天后,长出黄色、致密的愈伤组织;D、愈伤组织的芽诱导将步骤C中得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上,该培养基为MS+6-+,%的琼脂、3%%的活性炭,培养35~40天后,,出现丛生羌活苗;E、生根培养等步骤D中的丛生羌活苗长至2~3厘米时,转入生根培养基中,该培养基为
1/2MS+,培养基中加入2%的蔗糖、%的琼脂,培养20~30天后,小苗基部出现白色短根并长出完整根系;培养温度及光照条件温度为21±2℃,光照强度为1600Lux,光照时间为14小时;F、植株移栽将步骤E中得到的完整小苗直接移栽到经消毒处理的含蛭石、泥炭的育苗基质上,长成正常羌活植株。
所述的育苗基质的理化性质为总孔隙度为75%,有机质含量为20%。
实施例3一种羌活组织培养繁殖方法,包括下列步骤A、,用流水冲洗3~5分钟,再用75%的酒精灭菌45秒,以无菌去离子水冲洗2次,%的升***,灭菌12分钟,无菌去离子水冲洗3次,最后用无菌滤纸吸干水分备用;B、外植体接种在超净工作台上,~,接种在愈伤组织诱导培养基上,该培养基为MS++2,4-+,%的琼脂、3%%的活性炭,培养30~35天后,在根芽切口处膨大形成愈伤组织;
所述的MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962的简称,KT为6-糠基腺嘌呤,2,4-D为2,4-二***苯氧乙酸,NAA为萘乙酸;C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,该培养基为MS++2
