【摘要】：软枣猕猴桃(Acitinidia arguta)原产于中国,它不仅果实风味独特,方便食用;而且,植株具有很强的抗逆性,是优良的砧木材料,因此,具有广阔的市场前景和开发利用价值。软枣猕猴桃属雌雄异株,遗传背景复杂,传统的杂交育种方法存在周期长、效率低等问题,获得优质的软枣猕猴桃品种比较困难。基因工程的发展为软枣猕猴桃的育种工作开辟了一条新途径。高频稳定的植株再生体系是开展遗传转化工作的基础,但是,迄今为止,国内外有关软枣猕猴桃离体再生的报道较少,并且这些再生体系都存在再生率低、再生体系不稳定等问题,而且软枣猕猴桃的遗传转化参数差异较大、转化率低,缺乏一个完整的遗传转化体系。基于这些研究现状,本试验以红肉软枣猕猴桃叶片和茎段为材料,建立其高频离体再生体系,同时,以叶片为受体材料,进行了遗传转化的研究。其主要研究结果如下:1.以‘维基’、‘紫色萨多瓦’和‘红色九月’3种软枣猕猴桃的叶片为外植体再生不定芽。研究表明:‘紫色萨多瓦’的再生率和丛生芽效果是最好的,因此,选择‘紫色萨多瓦’作为后续研究材料。2.以‘紫色萨多瓦’叶片和茎段为外植体建立离体再生体系,结果表明:在愈伤组织诱导和增殖中,6-BA+2,4-D组合的效果优于6-BA+NAA,而且,叶片和茎段在6-BA+2,4-D培养基上诱导的愈伤组织平均鲜重显著的高于在6-BA+NAA的培养基上诱导的,愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D。

在光照处理中发现光照强度对愈伤组织增殖具有抑制作用,愈伤组织适合在黑暗环境中培养。‘紫色萨多瓦’植株再生的最佳条件为:叶片基部在MS+3.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA的MS培养基上暗培养30 d,然后转移到光下培养,再生率可达到80.00%,平均不定芽数为16.00。不定芽最佳增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L GA_3。最佳的生根培养基为1/2MS+0.7 mg/L IBA。3.比较了叶片对Kan和Hyg两种抗生素的敏感性,结果表明:叶片对Kan的耐性较强,而叶片对Hyg更敏感,当Hyg为10 mg/L时,叶片无愈伤组织长出,并且部分叶片开始褐化死亡,所以,选择10 mg/L Hyg作为抗性筛选的临界浓度。4.用农杆菌EHA105转化‘紫色萨多瓦’叶片,通过GUS染色分析,得出了该转化体系的最佳参数。结果表明:预培养4 d,OD_(600)为0.4～0.6,浸染20～30min,菌株培养液和共培养基中同时添加100μmol/L AS和共培养3 d是‘紫色萨多瓦’叶片最佳的转化条件,通过该体系得到的遗传转化率高达21.00%。在抗性筛选阶段,抗性愈伤组织的再分化能力差,因此,在供试的1600个外植体中只得到了抗性愈伤组织,没有得到抗性芽。通过GUS染色可知,抗性愈伤组织被染为蓝色。