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【关键词】 细胞凋亡

Effect of genistein on apoptosis and proliferation of rat mesangial cells cultured in high glucose

【Abstract】 AIM: To evaluate the effect of different concentrations of genistein on the proliferation and apoptosis of rat mesangial cells cultured in vitro in high glucose。 METHODS: Mesangial cells were treated in different groups。 Control group (low glucose 1 g/L without genistein) and experimental groups (high glucose 4。5 g/L with genistein 0， 1， 5， 10， 30 and 50 μmol/L) were established and incubated for 12， 24， 36 and 48 h。 The proliferation effect of genistein on cells was measured by MTT method。

Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from different groups， the terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique and flow cytometry using propidium iodide staining were performed to identify or quantify the apoptosis of cells。 RESULTS: Quantitative analysis of apoptotic cells showed that the apoptotic rate of the mesangial cells treated with genistein for 24 h was significantly higher， in 10， 30 and 50 μmol/L genistein groups than that in normal control group (P

【Keywords】 genistein；cell proliferation；apoptosis

【摘要】 目的：探讨金雀异黄素对体外高糖条件下大鼠系膜细胞（MC）增殖及凋亡的影响. 方法：对照组：低糖DMEM培养液（不含金雀异黄素），实验组：高糖DMEM培养液（含0，1，5，10，30，50 μmol/L金雀异黄素），各组分别培养12，24，36，48 h. 氮蓝四唑盐（MTT）法检测MC的增殖情况，DNA琼脂糖电泳、末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法、流式细胞术3种方法检测细胞凋亡情况. 结果：10，30，50 μmol/L金雀异黄素作用24 h可明显诱导细胞凋亡（P

【关键词】 金雀异黄素；细胞增殖；细胞凋亡

0引言

糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病最常见和严重的并发症之一，是造成终末期肾衰的主要病因，具体发病机制目前尚不清楚. 近年发现大豆及大豆蛋白具有加速脂质清除、抗动脉粥样硬化、抗氧化等生物功效［1］，这些作用与其中所含的多酚类混合物－大豆异黄酮密切相关. 肾脏血管病变、高脂血症和氧自由基等是DN发生和发展的重要因素，大豆异黄酮的上述功能，暗示了它们可能对肾脏细胞具有良好的保护作用［2］. 目前此类物质对肾脏细胞直接影响的报道较少. 肾脏系膜细胞（mesangial cell， MC）是致病因子作用的主要靶细胞. 我们研究大豆异黄酮的主要生理活性成分―金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC生长的影响如下.

1材料和方法

1．1材料

大鼠MC株38℃水浴复苏，生长于含60 mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养液中，7 d左右达融合状态，实验采用传代的第3代MC，进入实验后无血清（5 mL/L）培养，分别在金雀异黄素作用的12，24，36和48 h终止培养. 实验分为对照组：低糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度1 g/L不含金雀异黄素）;实验组：高糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度4.5 g/L金雀异黄素浓度为0，1，5，10，30和50 μmol/L），空白对照组只加培养液无细胞. Genistein购自Sigma公司（Mr 270.2，纯度≥98%），取Genistein 5 mg溶于1.85 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配成1×10-2 mol/L母液，实验时按需要稀释成各浓度工作液. 细胞凋亡检测试剂盒购自宝灵曼公司，细胞周期检测试剂盒购自BectonDickinson公司，噻唑蓝(MTT)购自上海华舜生物试剂公司.

1．2方法

1．2．1MTT法检测细胞增殖MC生长于96孔培养板（1×104／孔），24 h后换不同浓度金雀异黄素的无血清培养液，培养结束后每孔加入MTT液20 μL，37℃，50 mL/L CO2继续培养4 h，反应结束后每孔再加入DMSO 150 μL，振荡至蓝紫色结晶完全溶解. 将溶解后的液体转至96孔酶标板，在A490 nm处以空白对照组调零，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度（A）值. 每组设4个复孔.

1．2．2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡MC生长于6孔板（3×105／孔），培养结束后2.5 g/L胰酶消化，收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞，3000 r/min常温离心6 min，加入0.5 mL DNA裂解液，37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 加20 g/L蛋白酶K 5 μL，55℃水浴过夜. 等体积酚、酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，自然晾干，加入pH 8.0的TE 400 μL摇匀，再加入10 g/L RNaseA 5 μL， 37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，自然晾干，加入TE 20 μL溶解，4℃保存. 琼脂糖电泳检测DNA纯度. 10 μL DNA溶液与4×上样缓冲液2 μL混匀后，于15 g/L琼脂糖凝胶100 V电压下电泳，紫外灯下观察并摄影.

1．2．3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡MC生长于含消毒盖玻片的6孔板（3×105／孔），终止培养后按以下流程处理细胞：40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗盖玻片，2 mg/L蛋白酶K消化细胞，于37℃， 50 mL/L CO2培养20 min，PBS冲洗盖玻片，加入100 μL TUNEL缓冲液，37℃，50 mL/L CO2培养60 min，冲洗盖玻片，加入TUNEL标志物，37℃，50 mL/L CO2培养30 min，冲洗盖玻片，DAB显色10 min，蒸馏水冲洗，苏木素衬染，自来水返蓝，冷风吹干，明胶封固，60℃烤箱烤干. 显微镜下观察并照相，阳性标记细胞核为棕染棕黄色颗粒.

1．2．4流式细胞仪检测细胞凋亡MC生长于6孔板（3×105／孔），培养结束后2.5 g/L胰酶消化细胞，收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞，3000 r/min常温离心5 min，弃上清，按细胞周期试剂盒说明书操作：加入Buffer缓冲液1 mL，3000 r/min常温离心5 min，弃上清，加入Buffer缓冲液1 mL，3000 r/min常温离心5 min，弃上清. 加入Solution A 250 μL，摇匀，室温放置10 min；加入Solution B 100 μL，室温放置10 min；最后加入Solution C 100 μL，4℃放置10 min，上机检测细胞周期及凋亡率. 每个实验重复3次. 以CellQest软件分析细胞周期及凋亡率.

统计学处理：计量资料用x±s表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较用Dunnettt检验，使用SPSS 10.0软件进行统计分析，P

2结果

2．1MTT法检测细胞增殖在高糖培养的早期（48 h以内），高糖可促进MC的增殖（与对照组相比P5 μmol/L）对细胞的抑制作用较强，作用具有时间、剂量依赖效应(Tab 1).表1金雀异黄素作用下大鼠系膜细胞增殖状况（略）

2．2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡高浓度组10，30，50 μmol/L组作用24 h，DNA琼脂糖凝胶电泳出现特征性的由大小不同的DNA片段组成的数条梯形条带（DNA ladder）；5 μmol/L组出现模糊不清的条带；0 μmol/L组、1 μmol/L组与对照组在离加样孔不远处，为大分子基因组DNA条带表现，无梯形条带出现，意味着几乎没有细胞凋亡的发生(Fig 1).

2．3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡金雀异黄素浓度为10，30，50 μmol/L组作用24 h，细胞核呈现数量较多的棕染棕黄色颗粒，0，1 μmol/L组和对照组基本无棕染棕黄色颗粒出现，而5 μmol/L组有少量出现（Fig 2）.

2．4流式细胞仪检测细胞凋亡金雀异黄素作用于同一时间，实验组（10，30，50 μmol/L）MC的凋亡率明显高于对照组，5 μmol/L组的凋亡率略高于对照组，而0，1 μmol/L与对照组相比无明显差异（Fig 3）.同一浓度10 μmol/L金雀异黄素随着作用时间的延长，凋亡率亦增加.

3讨论

体外葡萄糖1 g/L升至4.5 g/L时对MC具有双重作用， 培养24~48 h内可刺激细胞增殖，72~96 h则抑制细胞增殖，促使细胞发生肥大. 我们将4.5 g/L葡萄糖作用于MC，在48 h内可促进MC增殖.细胞的凋亡与增殖平衡是组织保持一定的细胞数量，维持正常生理功能的主要因素［3］. 许多研究表明，细胞凋亡是使增殖的肾小球MC数量和结构恢复正常的重要机制［4］. 在DN的治疗过程中，有效地阻止早期MC过度增殖及细胞外基质（ECM）的聚积，是防止肾小球硬化的理想措施. 金雀异黄素是一种天然异黄酮类物质，具有雌激素活性作用［5］，同时具有抗氧化、抗炎和抗增生等特性，是酪氨酸激酶（PTK）［6］、DNA拓朴异构酶Ⅱ和核糖体S6激酶的抑制剂，能调控细胞周期的有丝分裂、细胞生存、细胞转化和诱导细胞分化. 我们发现，在48 h内，1 μmol/L金雀异黄素对细胞增殖影响不显著；高浓度的金雀异黄素（>5 μmol/L）对细胞增殖具有显著的抑制作用，作用具有时间依赖、剂量依赖关系. 如果金雀异黄素促进DN早期增殖的MC凋亡能得到进一步确证，则有可能起到延缓早期病情进展的作用.

【参考文献】

［1］ Anthony MS. Soy and cardiovascular disease: Cholesterol lowering and beyond［J］. J Nutr， 2000;130(3):662-663.

［2］ Velasquez MT， Bhathena SJ. Dietary phytoestrogens: A possible role in renal disease protection［J］. Am J Kidney Dis， 2001;37(5):1056-1068.

［3］ Roos A，Sato T，Maier H，et al. Induction of renal cell apoptosis by antibodies and complement［J］. Exp Nephrol， 2001;9:65-70.

［4］ Amore A， Coppo R. Role of apoptosis in pathogenesis and progression of renal disease［J］. Nephron， 2000;86:99-104.

篇6

富水河畔的通山县是中国最早的县级红色政权诞生地之一，也是一个集“老、库、山、穷”于一体的省级贫困县。近年来，通山县主动适应精准扶贫的工作要求，创新扶贫模式、突出产业发展，探索多种产业扶贫模式，带动贫困户参与产业经营，让贫困户“山上生金、水里流金、屋顶披金”，形成了“政策资金跟着穷人走，穷人跟着能人走，能人跟着产业项目走，产业项目跟着市场走”的新格局。

景区“带”火农家乐

“最近气温比较高，来赏花、漂流的游客比前一阵子多了不少。”阮家岭农庄负责人阮世灿看着络绎不绝的客人满脸欣喜。

2016年以来，通山县依托当地的生态优势和地域特色，大力打造生态旅游景区，建设主题公园、农耕文化园、休闲农庄等。通过景区景点的开发，不断带动贫困户融入旅游产业链，发展乡村旅游和农家乐，实行“景区景点+农家乐+贫困户”的模式，带动贫困户脱贫致富。杨芳林乡、黄沙铺镇利用丰富的自然资源，开发建成樱花、杜鹃花景区，每年能吸引2.3万名游客。景区带动了12户贫困户、52人参与农家乐经营，人均月工资达1500元，贫困户在家门口实现了脱贫致富。

“自黄沙铺镇景点开发以来，我们就一直想要开办个农家乐。”阮世灿告诉记者，经过多方筹备，阮家岭农庄终于在2016年9月开业，借着镇里大力发展赏花、漂流等旅游产业的东风，农庄的生意也跟着“火”了起来，开业才一年毛收入已达到30万元。富起来的阮世灿并没有忘记贫困乡亲，“政府给了我们这么好的机会，我现在富起来了，乡亲们还受着穷哪。”

开业以来，阮家岭农庄主动为贫困户提供就业岗位，带动村内贫困户脱贫，孟玉兰便是其中的一个受益户。“以前，我们家就靠我跟孩子他爸打工赚钱养家，家里人多，我们收入又不稳定，家里生活很困难。”说起之前的境遇，孟玉兰眉头紧锁。“现在好了，我在这边上班，一个月能拿2500元，还能照顾家里，这么好的工作，我可得好好干。”

截至目前，通山县已创建国家4A级旅游景区2家，注册旅游企业45家，创办农家乐1200家，提供就业岗位3万余个，带动1.6万贫困人口实现增收。

互联网“带”起电商潮

远在深山，却能在网络上“晒出”自己的特色让“大家识”，淘宝、京东等网站上的通山馆，阳春圆饼、九宫山茶油等通山农特产品赫然在列，销往全国，通山县“一村一品”的产业发展愿景呼之欲出。

在产业扶贫中，电商是重要的一招。通山县坚持线上农产品与线下产业链相结合，引导贫困户通过开网店或参与产业链实现增收。率先抢抓“全国电子商务进农村示范县”试点机遇，加强与阿里巴巴集团公司合作，建成阿里巴巴、京东县级服务中心和仓储物流中心，建设农村电商服务站点41个，电商大楼入驻会员企业40余家，电子商务创业就业人员达到1万人。

在大力为发展电商提供基础的同时，通山县还深知“授人以渔不如授人以渔”的道理。紧扣贫困户需求，对症下药、因户精准施策，对其进行订单培训、上门培训、电商培训等。成卫卫是通山县九宫山镇人，2007年因为一场交通意外导致高位截瘫，从此完全丧失了生活自理能力，紧接着父亲离世，只剩下她与母亲相依为命，几十万元的债务像一座大山压在母女俩瘦弱的肩膀上。“后来县里鼓励我们搞电商，我想自己虽然身体残疾了，但是不能成为社会的负担，于是报名参加了县里的电商培训。”成卫卫说。随后，掌握了电商技术的成卫卫在淘宝上开了店，销售化妆品，现在月平均交易额2万元，月收入2000元以上。“感谢政府、感谢电商，让我重新看到了生活的希望。”成卫卫感叹道。

目前，通山县共有140余个村形成了“一村一品”发展态势，6800户贫困户参与到楠竹、茶叶、油茶、香菇、小龙虾等产业链，484户贫困户发展电子商务。电商扶贫成为通山群众创业脱贫新时尚。

能人“带”动发展热

大路乡孔雀养殖能人大户王文教，投资1.2个亿建成100亩的孔雀山庄，养殖良种蓝孔雀。

“大路乡山清水秀，环境优美，特别适合孔雀的生长和繁殖，我有养孔雀的技术，回来创业既能发展自己的产业，又能为乡里乡亲们做点事。”王文教说。为了带动更多的贫困户通过养殖孔雀脱贫，山庄向有养殖意愿的贫困户免费提供孔雀幼苗、养殖技术和饲料，由贫困户代养10-12个月，山庄按照100元/只的价格进行回收，贫困户零风险养殖。犀港村村民杨大意，几年前丈夫去世后，独自抚养着两个年幼的孩子，日子过得紧巴巴。

一家人的境况从2016年9月开始改变：“基地为我们免费提供幼苗和饲料，还教给我们养殖技术，养殖若有损失由山庄全包，我们没有后顾之忧。”说起这些，杨大意脸上露出了满意的笑容，“仅通过养殖孔雀这一项，我今年能增收2万元呢。”目前，山庄共带动45户贫困户养殖蓝孔雀，平均每户养殖300只、年增收达到3万元。

为了充分l挥能人大户的技能、经济、创业优势，鼓励贫困户参与到能人大户的产业中，通山县政府整合财政、扶贫、农业、林业等部门项目资金1亿元，设立扶贫产业基金，专门用于支持产业发展。开发“精准扶贫贷”，每年整合1000万元，作为贷款风险补偿金，进行1：10放大，支持贫困户发展产业。贫困户可以通过产业扶贫基金、扶贫贷款等资金，以挂靠合作社或大户等方式，参与产业发展，合作社或能人大户给予贫困户保底分红。通羊镇茅田村就有5户贫困户将扶贫贷款挂靠到村内的香菇合作社，每户每年可收入5000元。

土地租赁“带”出新工作

越来越多的“空心村”带来的是越来越多土地的荒芜。对此，通山县大力在湖北省范围内开展农村土地经营权确权登记，并颁发证书，鼓励和引导贫困户将土地经营权有序流转，既能增加收入，又能提高土地利用率。政府还为流转土地的贫困户“打好了算盘”：将这些释放的劳动力组织起来，成立农机、施肥、修剪、打药等劳务服务队，返聘到产业基地务工，让他们由农民变为产业工人。

燕厦乡依托当地优势资源，大力发展新型产业，引进南山湖生态农业有限公司。目前，该公司已从群众手中流转土地3000亩用于苗木种植，投资2亿元建成集四季采果、观景、赏花、参与式劳作等功能的现代星级农庄，返聘80余户贫困户就地务工，贫困户不仅得到了土地资金，还拿到了务工薪金。成金林是燕厦乡北冲村村民，一家八口人，老伴和大儿子常年患病，没有劳动能力，一家人只能靠着几亩地的微薄收入过活，生活早已捉襟见肘。自南山湖生态农业有限公司基地项目在当地落成后，他家的生活条件有了明显的改善。“公司租用了我家的林地，还给我安排了工作。现在，我每个月都能收到租金和工资，足够我们一家人用。”说起乡里的租赁返聘老成竖起了大拇指。

2016年该乡又成功引进南京中电电气公司，在理畈村建立了100兆瓦地面光伏发电站。该项目建成后，既可让群众得到荒山租金增收，又可为贫困群众提供100余个就业岗位，实现200余万元的劳务增收。

篇7

孔雀草的繁殖

孔雀草的繁殖，用播种或扦插均可。播种宜于11月至次年3月间进行，可在庭院直播或盆播。盆播的，播种后约1个月即可挖苗上盆定植。扦插繁殖可于6至8月间剪取长约10厘米的嫩枝直接插于庭院，遮荫覆盖。

孔雀草的养护

1.光照调节：孔雀草为阳性植物，生长、开花均要求光照充足。但高温季节需要避免直射阳光，正午前后要遮荫降温。

2.温度控制：孔雀草上盆后温度降至18℃，开花前后温度可低至12℃-14℃。这样的温度对形成良好的株形是最理想的。但在实际生产中可能难以达到此条件。所以，一般来讲，只要温度在5cc以上孔雀草就不会被冻伤，10℃～30℃均可良好生长。

3.水肥管理：水分管理的关键是采用排水良好的介质。保持介质的湿润固然重要，但每次浇水前适当的干燥也是必要的。对于完全用人工介质栽培的孔雀草，可7-10天交替施肥一次。冬季气温较低时，要减少施肥量。如果是以普通土壤为介质的，则可以用复合肥在介质装盆前适量混合作基肥。肥力不足时，再追施肥料。

病虫害防治

孔雀草常见的病害有褐斑病、白粉病等，属真菌性病害，应选择好的植株苗进行栽培，并注意排灌，清除病苗、病叶，烧毁残枝，及时喷锈粉宁等杀菌药。常见的病虫害主要是红蜘蛛，在虫害发生初期可用20%的三氯杀螨醇乳油稀释500-600倍进行喷药防治。早春钓鱼技巧 老翁

变钓位：早春钓位应选择背风向阳一侧。水中若长有水草，钓位则应定点于浅滩部位：若无水草则移居深水与浅水相接的部位。

变饵料：初春垂钓宜采用适合多种鱼口味的混合饲料，其主要成分有大米、小米、麸皮、玉米渣、油籽饼、酒糟、芝麻等。自然水域中用量宜少食多餐，鱼池则施重饵适时补窝，也可贴近塘主所喂饲料，以适应池鱼的口味，提高钓获量。

变钓组：要变长竿为短竿、粗线为细线、大钩为小钩、大漂为小漂。

篇8

青岛动物园西区有青岛动物园小熊猫馆，内有大熊猫。

其位于青岛动物园西区，青岛动物园两栖爬行馆以东，原为孔雀馆。外观属典型的傣族建筑风格，两座双层绿色大坡顶竹楼，混合结构，建筑面积120平方米。建筑造型别致，周围由花架回廊环抱，面向水面的西墙壁上，镶嵌彩釉壁画《孔雀公主》，别具一格，有浓厚南方气息。

1995年，孔雀移至孔雀园散养，竹楼主要用于繁殖孔雀用。2004年，改建为小熊猫馆，兼养部分禽类动物。馆内保持“自然”生态环境，活动区域铺栽常绿草坪，鹅卵石砌水塘，搭建小竹屋、堆积景石假山，种植竹林。2004年九月，引进4只浣熊，禽类全部搬出。