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黄曲霉毒素(a flatox ins, AFT) 为真菌次级代谢产物, 为一组化学结构类似的化合物, 其基本结构为二呋喃环和香豆素, 主要有AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, 以及2种代谢产物AFM1和AFM2, 其中AFB1毒性最强也最为常见。AFT 主要是由曲霉属的真菌黄曲霉Aspergillus f lavus和寄生曲霉Aparasiticus产生的。另外, 在某些局部地区也发现Abombycis,赭曲霉Aochraceoroseus, 溜曲霉Atamarii 和集蜂曲霉Anomius可以产生AFT。

ATF是一种毒性很强的肝毒素, 可引起肝脏的急慢性损害, 同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害, 并具有致癌、致畸、致细胞突变的作用。ATF广泛存在于玉米、麦类、稻谷等农产品以及坚果、花生和动物饲料中,严重危害人、畜、禽类健康。近10年来, 有陆续报道我国中草药上ATF污染也很严重, 但尚未起管理部门和公众的广泛认识。由于药用植物被广泛用于治疗、膳食补充剂和日常食品中, 因此, 充分了解药材及相关制品的污染状况、污染途径和影响因子, 并采取有效的方法进行防治, 对提高药品食品安全性和保障人民健康有着非常重要的意义。

1. 中药上黄曲霉毒素的污染状况

1.1中药材及饮片上黄曲霉毒素的污染中药材种类繁多, 种植地区广泛, 多数药材在生产、加工、贮藏运输的过程中, 由于条件和技术简陋, 很容易发生霉变而污染黄曲霉毒素。2002-2015年, 北京市药品抽验情况表明中药材及饮片的不合格率最高, 在2.7%~12.9%, 平均不合格率为6.1%；2015年上海市药品抽验结果表明不合格药品中, 药材(饮片)占55.1%, 其中霉变药材约占18.3%。

由于不同药材上生长的真菌类群或者说污染真菌有差异, 并且由于菌的污染时间和生长量的差异, 会造成AFT污染的程度有所不同。总结了近年来不同研究者及各地药检所的6篇检测报告中, 报道2次以上有AFT污染的28个中药材及饮片品种 , 见表1。由于不同报道检测的药材品种数不同, 表中数据并不代表污染频率, 但其中报道较多的品种, 如神曲、淡豆豉、陈皮、麦冬、当归、山药、山茱萸、杏仁、薏苡、胖大海等药材, 可以认为其污染的可能性较大。在我国, 曲霉和青霉多用于制备各种发酵食品, 也用于制备六神曲、淡豆豉、红曲等中药, 在发酵过程中如果混入同类污染菌一般很难区分, 极易造成AFT污染。

从检测结果看, 神曲、淡豆豉确实污染严重。此外, 黄芪、番泻叶在出现的2篇报道中AFB1 的质量分数均在100ng.g-1以上, 也是需要关注的品种。表中结果采用的均是ELISA 测定方法, 对比发现相同药材不同来源的样品检测结果有很大差别, 一方面说明药材污染水平受地区和环境影响极大, 另外可能与使用的试剂盒不同有关, 需要尽快建立标准的测定方法。

1.2 中药制剂中黄曲霉毒素的污染. 土壤和空气中存在的产AFT 的曲霉属真菌, 可以直接污染药材或保存不当的中药制剂。另外, 被产毒菌污染的药材在作为相关制剂的原材料时, 会导致中成药的间接污染。传统中药的丸剂、散剂、片剂中往往含有大量药材原粉, 生产过程中如果消毒不严则很容易造成污染。中药中的发酵制剂由于工艺问题被曲霉污染的几率非常高, 因此, 中成药中含有豆豉、曲类药材往往也是造成污染超标的直接原因。任凤兰、马宏伟检测了不同批号的25批含豆豉、曲类的中药制剂中AFB1的含量, 检测结果显示100%污染AFB1, 沉香化滞丸、银翘解毒丸、柏子养心丸的AFB1质量分数均在600ng.g-1以上。卢志雁等[ 16]对神曲、越鞠保和丸、肥儿片等7种药物中黄曲霉素进行了测定与分析, 结果表明神曲中为200~229 ng.g-1, 越鞠保和丸中达到1.056ng.g-1; 刘鹏等[17]对18批中成药黄曲霉毒素的检测结果有15 批不同程度地污染有AFB1, 占83%,其质量分数均小于1ng.g-1。梁秋月检测了22 批中成药中AFB1, 结果有19批中成药污染AFB1, 占86%。李延生检测银翘解毒丸和清眩治瘫丸的AFB1分别为29.5, 23.7ng.g-1 [ 9] 。汤杨[ 12] 检测了44个品种的中成药(含片剂、冲剂、丸剂、胶囊剂), AFB1检出率达89%。以上结果表明了含豆豉、曲类中药制剂污染AFB1的严重性。

1.3 关于黄曲霉含量检测限量标准. 联合国有关组织(WHO, FAO, UNEP等)于20 世纪90年代制订了AFBl在食品中的控制标准。1995年WHO规定的食品中AFBl最高限量为15.g.kg-1, 婴儿食品中不得检出AFBl；欧盟国家规定人类生活消费品中的AFBl不超过2.g.kg-1, 总量(指Bl+B2+G1+G2)不超过4.g.kg-1 。韩国食品医药品安全厅( KFDA) 发布了有关中药材中黄曲霉毒素B1限量标准和试验方法的公告, 要求甘草, 决明子, 桃仁等9味中药材黄曲霉毒素B1低于10.g.kg-1。目前, 我国卫生部已经制定了部分食品黄曲霉毒素含量限度的暂行标准, 但尚没有中药材、中药饮片以及中成药黄曲霉毒素含量限量的国家标准。从报道的中药材及中药制剂中AFT的污染水平来看, 很多种类大大超过了食品的限量标准。我国无论从保障中药及其相关产品的安全性, 及出口中药材的管理方面, 均需要对黄曲霉毒素污染问题给与充分重视。

2. 黄曲霉毒素的污染途径及影响因子产AFT 的真菌广泛存在于空气、土壤中, 中药材在种植、加工、贮藏等各个环节都有可能污染产毒真菌。大量的研究结果证实, 这类真菌能够侵染多种农作物并在其中生长, 气候条件对AFT 污染水平有很大影响。作物收获前遭遇炎热、干旱的气候能够刺激产黄曲霉毒素的真菌生长, 因此当生产地大面积出现这种气候时, 会导致农作物明显的感染黄曲霉毒素的现象； 如果农作物在生长过程中遭遇病虫危害、土壤贫瘠、早霜、倒伏以及潮湿多雨等情况, 也会促使AFT 的产生。

市场上销售的中药材多为饮片形式, 将收获后的药用植物加工成饮片是中药的独特加工方式。撞皮、发汗、发酵、以及炒制、蒸制、醋制等各种特殊的炮制工艺是否对污染真菌及AFT 含量产生影响很少有报道。张振凌等比较了炒制、醋制、火單制、酒蒸等不同炮制方法对酸枣仁、五味子、杏仁、山茱萸等13种中药饮片中AFB1含量的影响。结果发现AFB1的含量变化随加热炮制的方法不同而不同, 山萸肉饮片中AFB在炮制后降低, 多数种子果实类药材的AFB1生品含量和炮制品的含量差别并不显著。生品牛膝与酒制后微生物数量及AFB1含量无明显差异, 加热炮制能够降低饮片AFB1的含量, 但对含量较高者炮制并不能使其达到安全范围。这是因为AFB1是一种耐高温的毒素, 在280 . 时才发生降解, 一般的文火加热炒黄炮制方法对其起不到破坏作用。

贮藏期中药黄曲霉毒素的污染主要是由于储存条件不当造成的, 如仓储温度高、湿度大、通风透气条件不良等。产生ATF的黄曲霉A.flavus和寄生曲霉A.parasiticus 适宜生长在高温高湿的环境, 因此在温度较高的地区AFT引起的污染往往较为严重。

3. 黄曲霉毒素污染的防除技术AFT的污染源头在于产毒真菌, 消除产毒真菌是控制ATF污染的关键。虽然中药材发霉的现象非常普遍, 但由于管理、经济以及人们意识上的问题, 一直未引起业内的足够重视, 目前市场、药店、生产厂采用的传统防除方法难以消除AFT污染。产AFT的曲霉属真菌孢子干热致死温度为120度, AFT不溶于水, 并且耐热性高, 一般的洗、刷、晒及加热炮制等均无法杀灭产毒霉菌降低AFT含量, 中药材一旦发生霉变污染AFT后, 一般很难消除。因此, 从中药生产到上市的各个环节中, 预防产毒菌污染并控制菌的生长是从源头解决问题的根本措施。

3.1 种植过程中产毒真菌的预防技术 药材上污染的产毒真菌很大一部分来源于种植环境, 加强田间管理, 提高植物的抵抗力是防止污染的主要方法。近10年来发展起来一些新的生物技术也开始使用。生物竞争抑毒( competitiveexclusion)技术是一种可以用于田间生长作物的AFT防治技术,它通过在土壤中接种具有强竞争能力的不产毒真菌菌株, 与土壤中已存在的产毒菌株竞争侵染位点, 在一定程度上抑制产毒菌株侵染作物, 从而达到减少或消除毒素产生的作用 。国外在20世纪90年代初开始这方面的研究, 并初步应用到花生、玉米和棉籽等大田作物中。另外, 筛选和利用拮抗微生物也是抑制ATF的新途径, Down等报道一株枯草杆菌B.subtilis可显著抑制黄曲霉对玉米的侵染和毒素的产生。对于通过发酵生产的曲类、豆豉类药材, 由传统的自然发酵生产改为纯种发酵, 是控制产毒菌株污染的有效途径。

3.2 贮藏过程中的防霉技术. 产毒真菌最适生长及产毒温度在25~30度, 最适相对湿度为80%~90%。我国南方地区的气温、湿度更适合于黄曲霉菌的生长和产毒, 特别是梅雨季节, 以往对谷物和饲料污染情况的调查也证实热带地区污染更为严重。通过控制环境温湿度和水分活度, 改善储藏条件, 同时控制药材及原料药的水分含量, 是目前采用的最常见和实用的抑制霉菌方法。贾传春报道药材中水分控制在15%以下可以有效防霉菌生长。以往对不同作物防霉研究表明, 一般谷物含水量在13%以下, 玉米在12.5%以下, 花生仁在8%以下, 霉菌不易繁殖；理想储存条件是干燥低温状态, 温度在12度, 能有效控制霉菌繁殖和产毒。而对不同药材贮藏的适宜含水量的研究尚为空白, 实际操作中没有可参考的标准。

现代辐射技术也可以用于杀灭霉菌, 防止ATF污染。钟海袼报道用8000Gy剂量的60Co-射线照射后, 可杀灭药材上的所有微生物, 对药材质量无不良影响。陈业欢报道微波处理后密闭保存可有效防止虫蛀和霉变, 大黄、紫草、桔梗、杏仁有效成分影响不大。张选明等研究出在含水量低于12%前提下, 采用聚乙烯薄膜密封包装与60 Co-.射线辐照(

3.3 基因工程技术. 基因工程技术的发展为解决AFT污染问题提供了新的契机。在产毒真菌的研究方面, 以往研究证实, 曲霉属真菌的大部分种都不产毒素, 如A.oryzae和A.sojae常被用于传统食品加工, 而A.flavus中也有50% 菌株不产毒。随着对黄曲霉毒素合成基因的发现, 已经可以从基因水平解释这种差异的根源, 可以期待通过基因工程技术消除产毒菌株中调控毒素合成的关键基因, 从而控制产毒。通过分子生物学的方法, 可以实现土壤中产毒真菌的快速定量检测 。

在寄主植物方面, 从自然界中存在的天然抗AFT污染的植物中, 通过对其相关基因的分析鉴定, 可以找出起抑制作用的关键基因。将这些基因或通过传统的栽培或通过基工程的方法转入到作物中去, 可培育出抗AFT的作物新品种。目前利用基因工程生产抗AFT作物还在大规模的试验阶段,研究人员已经鉴定、克隆了玉米和花生中大量编码抗AFT 因子的基因, 但这些基因在转入到作物后的正确表达还尚需时日。

4. 存在问题及对策

首先, 研究的系统性不够。在300多种常用的中草药中, 据初步统计已报道检测过ATF的药材和饮片品种仅有86种。中药制剂的污染主要与原料污染有关。并且在AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 4种AFT 中, 国内仅见到AFB1 的检测报道。采用的方法多为ELISA试剂盒, 同一种药材不同检测单位报道的检测结果差异大较大, 可能与样品的产地差异、试剂盒的精确度有直接关系。由于中药材中次生代谢产物丰富, 污染的情况可能与粮食和食品不同, 应加强对不同药材中几种主要AFT的检测, 完善检测方法。

其次, 检测过的药材样品数量和重复性不够。在检测过的药材中, 每种多则4批次, 少则仅1批次的结果, 很难准确反映某种药材污染的风险性。现有报道的检测时间主要集中在20世纪90年代末至21世纪初, 在检测的86种药材中,有84种有不同程度的污染, 初步结果已表明我国药材的污染状况不容忽视, 但近期报道极少, 说明其严重性并未引起足够重视。建议从国家层面上加强科研立项和经费投入, 在前期研究的基础上, 对污染较为严重的品种, 进行大范围的抽样调查, 对我国中药材及相关产品的污染情况进行系统性研究, 以了解中药上AFT 污染的实际情况, 从而实现有针对性和高效率控制AFT污染。

第三, 关于产毒真菌的基础性研究薄弱。产毒真菌是毒素污染的源头, 由于药材生产往往具有其特殊的饮片加工工艺, 污染真菌的来源及类群与农产品可能有很大不同。例如花生中主要的AFT 污染菌为黄曲霉, 而本课题组前期 在对ATF污染甘草的真菌类群分离鉴定中, 发现主要的产毒真菌为寄生曲霉。药材中次生代谢产物对产毒真菌的影响尚不明确。因此, 迫切需要加强对产毒真菌在不同药材上的污染风险性进行评估, 即明确哪些药材更容易污染, 及其主要污染途径。为科学合理地制订限量标准并建立切实可行的防霉技术提供依据。

第四, 目前使用的防控技术落后。我国有关AFT检测方法已有较多报道, 而对如何控制毒素及产毒真菌污染尚缺乏系统研究。田间防霉技术研究尚未开展, 现有的去除AFT的脱毒方法还仅限于洗、擦、熏、蒸等传统方法, 难以达到理想的结果, 所以从安全、经济的角度考虑, 笔者认为防毒应比脱毒更重要, 如何避免产毒真菌的污染将是工作的重点。可以通过摸索中草药的最佳储存条件(温度、湿度、水分活度等)来尽量降低产毒曲霉的污染和生长。辐照技术等现代物理防除技术, 为有效控制污染提供了新的方法。而生物防治将是一种中药材收获前田间控制的最有前景的策略, 其优点是不会影响产品品质及产生不良副产物, 但目前生物防治距离实际应用还有一定距离, 研发高效、广谱的微生物制剂及配套生产技术, 降低研发、生产成本是生物防治法获得广泛应用的关键。

综上所述, 我国中药材及相关制剂受到AFT污染的现状不容忽视, 在研究基础、研究的系统性及防除技术方面亟待加强。现代物理、化学、生物技术的应用, 将为克服毒素污染提供新的策略。